1、中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒MERSCoV實(shí)驗(yàn)室檢測-課件參考標(biāo)準(zhǔn)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南WHO: LaboratoryTesting for Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus：interimrecommendations (revised). (September2014 ）US CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from

2、 Patients Under Investigation (PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) - Version 2參考標(biāo)準(zhǔn)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實(shí)驗(yàn)室檢測MERS-CoV感染標(biāo)本采集對象中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例；其它需要進(jìn)行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。MERS-CoV感染標(biāo)本采集對象標(biāo)本采集要求從事MERS-CoV檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格且具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員進(jìn)行

3、安全防護(hù)。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。標(biāo)本采集要求從事MERS-CoV檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過采集標(biāo)本種類和要求呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標(biāo)本。每個(gè)病例應(yīng)盡可能同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本，下呼吸道標(biāo)本最佳，建議同時(shí)采集糞便和尿液標(biāo)本。應(yīng)盡可能采取發(fā)病初期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔1421天采集比較理想，第一份血清應(yīng)在發(fā)病第一周內(nèi)采集。但單份樣品的檢測對于確定疑似病例也有價(jià)值，如果只能采集一份樣品，應(yīng)該在出現(xiàn)癥狀后至少

4、14天采集。采集標(biāo)本種類和要求呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿標(biāo)本的保存樣品采集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程需合理。若呼吸道樣品72小時(shí)以上才能到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，強(qiáng)烈推薦將樣品儲存在-80并使用干冰進(jìn)行運(yùn)輸，應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。從全血分離的血清應(yīng)4儲存并運(yùn)輸，或用干冰、液氮冷凍并運(yùn)輸。由于無霜冰柜溫度波動較大，應(yīng)避免使用無霜冰柜儲存呼吸道和血清樣品。標(biāo)本的保存樣品采集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程需合理。院內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。為減少任何標(biāo)本破、漏的風(fēng)險(xiǎn)，不要使用任何氣動傳輸系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)任何可能疑似患者標(biāo)本。轉(zhuǎn)運(yùn)至CDC的MERS-CoV標(biāo)本應(yīng)該充分包裹，轉(zhuǎn)

5、運(yùn)時(shí)不能開蓋或分裝標(biāo)本。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內(nèi)層是主要的容器（一個(gè)可密封的標(biāo)本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉(zhuǎn)運(yùn)的包裝。MERS-CoV感染標(biāo)本包裝和運(yùn)輸院內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。 MERS-CoV感染實(shí)驗(yàn)室檢測方法核酸檢測：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)MERS-CoV感染病例的主要檢測方法，采用Real-time PCR 進(jìn)行病毒核酸檢測和診斷，患者呼吸道樣本中擴(kuò)增到特異性核酸，可確診MERS-CoV感染 。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列。抗原抗體檢測:IgM捕獲法ELISA檢測血清特異性

6、IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體利用假病毒進(jìn)行中和抗體檢測 MERS-CoV感染實(shí)驗(yàn)室檢測方法核酸檢測：為目前早期診中東呼吸綜合征冠狀病毒MERSCoV實(shí)驗(yàn)室檢測-課件MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測靶標(biāo)目前病毒核酸的檢測方法主要有：檢測E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測用于初篩;檢測ORF1b基因的方法不如針對ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個(gè)適合測序驗(yàn)證的靶序列。

7、MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測靶標(biāo)目前病毒核酸的檢測方法主要有巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸提取標(biāo)本采集PCR檢測熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA待檢樣品upE 特異性RT-PCR檢測陽性陰性O(shè)RF1a RT-PCR檢測陽性陰性確 診RdRp測序或N 測序陰性抗原檢測抗體檢測病毒分離陽性實(shí)驗(yàn)流程待檢樣品upE 特異性RT-PCR檢測陽性陰性O(shè)RF1a R繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測經(jīng)驗(yàn)的參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測入選病例rRT-PCR upE基因進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)陽性陰性rRT-PCR ORF1a、ORF1

8、b或N基因區(qū)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)陰性，但如果臨床和流行病學(xué)證據(jù)充分，繼續(xù)采樣重復(fù)檢測陰性陽性RdRp或N區(qū)測序?qū)嶒?yàn)陰性顯示為其他序列顯示MERS-CoV確診病例確診病例繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測經(jīng)驗(yàn)的參比實(shí)upEupE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGACCCATA-3upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3ORF1bORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-

9、3ORF1b-Prb 5FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3ORF1aORF1a-Fwd 5- CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3ORF1a-Rev 5- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3ORF1a-Prb 5FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3N2N2-Fwd 5- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3N2-Rev 5- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3N2-Prb 5FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3分子檢測引物與探針upE

10、分子檢測引物與探針Y=-3.56x+39.19R2=0.9881e6 1e4 1e3 1e2 Y=-3.56x+39.191e6 1e4 熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果判斷陰性: 無Ct值或Ct為40。陽性：Ct值37, 可報(bào)告為陽性。Ct值在37-40之間的樣本建議重做, 若重做結(jié)果Ct值 37，該樣本判斷為陽性, 否則為陰性。熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果判斷陰性: 無Ct值或Ct為40MERS-CoV核酸檢測結(jié)果報(bào)告在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)樣本為陽性，需要滿足以下兩個(gè)條件的其中一個(gè)：至少兩種MERS-CoV特異性PCR結(jié)果陽性；一種PCR結(jié)果為陽性，另外一種PCR產(chǎn)物序列測序，與MERS-CoV序

11、列相符。當(dāng)針對MERS-CoV的兩種不同的檢測方法結(jié)果不一致的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)采用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序以確認(rèn)檢測結(jié)果。MERS-CoV核酸檢測結(jié)果報(bào)告在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)樣本為陽性檢測結(jié)果判讀陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產(chǎn)生假陰性，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異，PCR抑制等。當(dāng)PCR檢測結(jié)果為陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示是MERS-CoV感染時(shí)，可采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測。雙份血清標(biāo)本能夠滿足血清學(xué)檢測的要求。檢測結(jié)果判讀陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素

12、可能產(chǎn)我國首例輸入性中東呼吸綜合征病例的實(shí)驗(yàn)室快速確診2015年5月27日晚10時(shí)世界衛(wèi)生組織向中國衛(wèi)生計(jì)生委通報(bào)，韓國1例確診中東呼吸綜合征（MERS）病例的密切接觸者經(jīng)香港入境廣東省惠州市。5月28日下午，經(jīng)廣東省疾控中心對病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，初篩結(jié)果為陽性。樣本接收時(shí)間：2015.5.29日凌晨1點(diǎn)40分（中國疾控中心病毒病所）實(shí)驗(yàn)室確診結(jié)果上報(bào)： 2015.5.29日凌晨5點(diǎn)40分我國首例輸入性中東呼吸綜合征病例的實(shí)驗(yàn)室快速確診2015年疑似MERS-CoV感染的實(shí)驗(yàn)室快速確診樣本來源：KIM MYEONGSHIK (韓國）廣東省惠州市樣本類型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份）采樣日期

13、：2015.5.28實(shí)驗(yàn)室復(fù)核檢測流程：BSL-3實(shí)驗(yàn)室：分裝滅活 BSL-2實(shí)驗(yàn)室：核酸提取 熒光定量RT-PCR (三個(gè)靶標(biāo)UpE、ORF1b和N2) 結(jié)果判定與報(bào)告 疑似MERS-CoV感染的實(shí)驗(yàn)室快速確診樣本來源：KIM M廣東省CDC疑似MERS-CoV感染的復(fù)核檢測UpE檢測擴(kuò)增曲線ORF1b檢測擴(kuò)增曲線N2檢測擴(kuò)增曲線廣東省CDC疑似MERS-CoV感染的復(fù)核檢測UpE檢測擴(kuò)增靶標(biāo)鼻咽拭子血（）（）（）（）123UpE 34.1833.933.84No CtNo CtNo CtNo Ct25.51ORF1b 35.8535.1634.73No CtNo CtNo CtNo Ct2

14、7.95N2 31.2131.2730.7636.5No CtNo CtND21.34疑似MERS-CoV感染的送檢樣本復(fù)核檢測熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果（Ct 值）靶標(biāo)鼻咽拭子血（）（）（）（）123UpE 34.1結(jié)論采用upE/ORF1b/N2 三個(gè)靶標(biāo)，進(jìn)行三種熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，在對照成立的基礎(chǔ)上，三管咽拭子樣本檢測結(jié)果皆為陽性?；贜2靶標(biāo)的熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，血清標(biāo)本呈弱陽性。結(jié)論：廣東疑似MERS-CoV病人實(shí)驗(yàn)室檢測確定為MERS-CoV感染陽性。結(jié)論采用upE/ORF1b/N2 三個(gè)靶標(biāo)，進(jìn)行三種熒光定量上海輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶標(biāo)）應(yīng)用驗(yàn)證MERS-C

15、oV RNA雙色檢測試劑盒ORF1b/upE （FAM/VIC）1 34 2 樣品編號CT值1陽性對照22.582咽拭子樣本36.35樣品編號CT值3陽性對照22.544咽拭子樣本33.17上海輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶標(biāo)）應(yīng)用驗(yàn)證MERS-CoV基于濁度儀和羥基萘酚藍(lán)顏色變化的簡單快速和靈敏的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RT-LAMP檢測方法的特異性濁度圖和顯色圖特異性高，檢測下限分別為每管反應(yīng)500與1000拷貝，有望應(yīng)用于MERS-CoV感染的快速篩選，具有在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場推廣和應(yīng)用的潛力基于濁度儀和羥基萘酚藍(lán)顏色變化的簡單快速和靈敏的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增RdRp或N基因后

16、測序檢測MERS-CoVRdRpSeq assay:EMC-SeqRdRP-Rev: GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG GEMC-SeqRdRP-Fwd: TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGCEMC-SeqRdRP-Rnest: CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC AW=A/T, N=A/C/T/G, R=A/GFragment size: first round : 242bp (including primers),second round 228 bp (including primers)Nseq assay:EMC-

17、SeqN-Fwd: CCT TCG GTA CAG TGG AGC CAEMC-SeqN-Rev: GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA CEMC-SeqN-Fnest: TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA CFragment size: first round : 306-312 bp (including primers),second round 279-285 bp (including primers)Reference:Corman/Mller et al.; Eurosurveillance, Volume 17, Issue 49, 06

18、December 2012RT-PCR擴(kuò)增RdRp或N基因后測序檢測MERS-CoVR通用引物檢測冠狀病毒冠狀病毒通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit； QIAGEN) 反應(yīng)條件：1. 反轉(zhuǎn)錄: 50 for 30min 2. PCR擴(kuò)增: 95 for 15 min (激活)，50 cycles (30 sec at 94 ；30 sec at 48 ；1min at 72 )，最后延伸 72 for 10min。引物對序列：Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-RV (5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3)通用引物檢測冠狀病毒冠狀病毒通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳IFA抗原片檢測MERS-CoV特異抗體IFA抗原片檢測MERS-CoV特異抗體中東呼吸綜合征冠狀病毒MERSCoV實(shí)驗(yàn)室檢測-課件中和抗體檢測利用MERS-CoV假病毒體系進(jìn)行中和抗體檢測，實(shí)驗(yàn)操作簡單而不受BSL-3實(shí)驗(yàn)室的限制（Virology Journal.2013;10(1):266)。中和抗體檢測利用MERS-Co