1、關(guān)于單核苷酸多態(tài)性及其應(yīng)用第1頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的概念 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP) 是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。 同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性 。第2頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四Single nucleotide polymorphism第3頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的特征 SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多

2、態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，人類DNA中每300-1000bp就有一個SNP. 因此，一個人類個體大約攜帶300萬-1000萬個SNPs。 第4頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的特征 一個SNP表示在基因組某個位點上一個核苷酸的變化， 作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（CT，GA），也可能是顛換。 具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的23左右。 轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生CT的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。第5頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四

3、 SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。 位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型(haplotype)，相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代.第6頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四第7頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為: 基因編碼區(qū)SNP(cSNP) 基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP) 基因間隨機編碼區(qū)SNP(rSNP) 等三類。 因為編碼區(qū)內(nèi)的變異率占周圍序列的1/5，cRNP的總量顯著少于其他兩類SNPs。第8頁，共44頁，2022年，5

4、月20日，2點3分，星期四 cSNP又可分為2種： 同義cSNP(synonymous cSNP)： 非同義cSNP(non-synonymous cSNP)第9頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四同義cSNP： SNP所導(dǎo)致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP： 指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。這種改變常常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。 位于基因調(diào)控區(qū)的SNP則會影響基因表達(dá)量的多少，因此，這兩類SNP在功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。第10頁，共44頁，20

5、22年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism,SSCP) 原理： 單鏈DNA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。第11頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理: 當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移

6、率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。 第12頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 Taqman法 以熒光共振能量傳遞(fluorescent resonance energy transfer,FRET)為基礎(chǔ)的檢測方法。 在PCR反應(yīng)中，將供者-受者染料對分別結(jié)合到Taqman探針的兩端，探針未與目標(biāo)序列結(jié)合時，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光；完全互補配對后，由于Taq DNA聚合酶具有5核酸酶的活性，可將供者從探針上切下來從而發(fā)出熒光。如果探針與目標(biāo)序列中存在錯配堿基，就會減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊

7、密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影響了供者的熒光釋放量，從而使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。第13頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 供者受者5 3 Taqman 探針第14頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 供者受者5 3 Taqman 探針第15頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 供者受者5 3 引物目標(biāo)序列第16頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四受者5 3 引物 供者目標(biāo)序列第17頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 分子信標(biāo)(molecular beacon)

8、法 分子信標(biāo)是一個U型的單鏈核苷酸探針（探針序列內(nèi)部可有一定程度的互補配對），在探針兩端也加上供者-受者染料對，U型探針使兩染料靠近，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光。當(dāng)探針與目標(biāo)序列完全互補配對后，兩染料分離，使得供者的熒光亮增加，如果目標(biāo)序列中存在錯配堿基，就會影響探針與其結(jié)合，從而影響到供者的熒光亮，使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。第18頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四供者受者第19頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 供者受者第20頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四焦磷酸測序法 焦磷酸測序法(pyrosequencing)是一種不

9、依賴平板膠或毛細(xì)管電泳，不依賴DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)/檢測體系的序列分析技術(shù)，適用于已知序列的DNA片段進行驗證分析，適用于已知SNP的序列驗證及基因分型。 第21頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 焦磷酸測序法主要是由四種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng): 包括DNA聚合酶、硫酸化酶、螢光素酶和雙磷酸酶; 反應(yīng)底物為adenosine 5phosphosulfate(APS)和螢光素。 反應(yīng)體系還包括待測序的DNA單鏈和測序引物。 第22頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四在每一輪測序反應(yīng)中，加入一種dNTP。 如該dNTP與模板配對，聚合酶就可以催化該

10、dNTP摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基團(PPi)。 摻入的dNTP和釋放的焦磷酸的物質(zhì)的量相等，反應(yīng)時dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代 因為DNA聚合酶對dATPaS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATP是螢光素酶的底物，dATPctS不是。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物質(zhì)的量和焦磷酸一致。第23頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 ATP驅(qū)動螢光素酶介導(dǎo)的螢光素向氧化螢光素(oxyluclferin)的轉(zhuǎn)化，氧化螢光素發(fā)出與ATP含量成正比的可見光信號。 光信號由CCD攝像機檢測并

11、通過相應(yīng)的軟件得到反映。 每個峰的高度(光信號）與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)成正比，ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，猝滅光信號，并再生反應(yīng)體系，加入另一種dNTP進行下一輪反應(yīng)。隨著以上過程的循環(huán)進行，互補DNA鏈合成，DNA序列信號峰確定。 該技術(shù)分析系統(tǒng)自動化程度高，通量大，速度快，易于建立標(biāo)準(zhǔn)化操作，適合大規(guī)模SNP研究及基因分型。第24頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四第25頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 動態(tài)等位基因特異性雜交法(dynamic allele specific hybridization,DASH) 用生物

12、素標(biāo)記一條引物進行目的DNA擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)生物素結(jié)合于鏈親和素包裹的微孔板壁，不帶生物素標(biāo)記的鏈用堿洗掉。加入探針和熒光染料，熒光染料SYBR Green可特異性地插入雙鏈中，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，而在單鏈中則不能；探針和產(chǎn)物單鏈雜交后，在儀中微孔板持續(xù)緩慢升溫，同時連續(xù)檢測各孔中熒光強度，將溫度及各孔中對應(yīng)的熒光強度輸入計算機, 基因型與探針完全匹配的樣品在較高溫度才解鏈,因此在較高溫度才得到d(Fluorescence)/dt峰;與探針不完全匹配的樣品則在較低溫度時就得到d(Fluorescence)/dt峰，雜合子則得到兩個峰。 第26頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3

13、分，星期四PCR擴增第27頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四鏈親和素包裹的微孔板 + 堿變性第28頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四持續(xù)緩慢升溫第29頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 第30頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 變性高效液相色譜(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) 原理第31頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四第32頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四第33頁，共44頁

14、，2022年，5月20日，2點3分，星期四第34頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四第35頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 -質(zhì)譜分析法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-flight mass spectrometry) 原理 ：適當(dāng)大小的有機分子晶體(介質(zhì))用接近其吸收光譜的激光瞬時激發(fā)，會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移及解吸附過程。如將低濃度的蛋白質(zhì)或核酸分子加入介質(zhì)溶液中并加以干燥，蛋白質(zhì)或核酸分子將嵌入到介質(zhì)晶體中。將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空小室，用瞬時(納秒)強激光激發(fā)，晶體中的蛋白

15、質(zhì)或核酸分子就會解吸附，轉(zhuǎn)變成氣相的離子態(tài)，此時可通過質(zhì)譜分析這些離子。 第36頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的檢測方法 DNA芯片技術(shù)（DNA chip） 將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變，該方法快速簡單、片動化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿?，將在基因突變檢測中心發(fā)揮非常重要的作用。 第37頁，共

16、44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四SNP的應(yīng)用 SNP作圖 利用SNP圖譜搜尋遺傳致病基因 SNP在藥物設(shè)計中的作用 SNP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 人類起源遷移進化的研究第38頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 1人類基因單體型圖的繪制 大多數(shù)染色體區(qū)域具有少數(shù)幾個常見的單體型，代表了一個群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。 某些染色體區(qū)域可以有很多SNP位點，但是只用少數(shù)幾個標(biāo)簽SNPs，就能夠提供該區(qū)域內(nèi)大多數(shù)的遺傳多態(tài)性模式。 繪制人類基因單體型圖的目的就是描述人類常見的遺傳多態(tài)性模式和染色體上具有成組緊密關(guān)聯(lián)SNPs的區(qū)域。第39頁，共44頁，2022年，5月2

17、0日，2點3分，星期四 2002年10月，國際人類基因組單體型圖計劃(HapMap計劃)正式啟動，截至目前已有超過150萬SNPs被精確定位于各染色體上，并且已根據(jù)這些SNPs對來自4個不同人種的269份DNA樣品進行了基因分型。 后期目標(biāo)是要使總密度達(dá)到每500bP有一個SNP。通過不同個體基因組DNA的基因分型和頻率計算，繪制更加精密的單倍型圖譜。人類基因單體型圖的繪制完成，將為我們精確定位復(fù)雜疾病(如糖尿病，癌癥，心臟病，腦猝和哮喘等)易感基因提供重要信息。第40頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四2 SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析 當(dāng)一個遺傳標(biāo)記的頻率在患者中明顯超過非患者時就表明該標(biāo)記可能與這種疾病相關(guān)、隨著大量代謝通路和上百萬SNPs的確認(rèn)，SNP作為新一代遺傳標(biāo)記在人類疾病研究中顯示出極高的潛在價值。 已經(jīng)有高血壓、哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肺癌、前列腺癌等許多易感基因通過SNP的相關(guān)研究被發(fā)現(xiàn)。 第41頁，共44頁，2022年，5月20日，2點3分，星期四 3指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計 由于SNP能夠充分反映個體間的遺傳差異，所以誦過研究SNP與個體對藥物敏感或耐受的相天性研究，可能