1、桃源豬場育肥豬大腸桿菌的分離鑒定與藥物敏感性研究PAGE PAGE 18本科生畢業(yè)論文(設(shè)計) 題 目：桃源豬場育肥豬大腸桿菌的分離 鑒定與藥物敏感研究 學(xué)生姓名： 學(xué) 號： 專業(yè)班級： 生物科學(xué)12102班 指導(dǎo)教師： 教授 完成時間： 2016年5月20日 目 錄TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc19688 摘要 PAGEREF _Toc19688 1 HYPERLINK l _Toc13708 1 引言 PAGEREF _Toc13708 2 HYPERLINK l _Toc23993 2 材料和方法 PAGEREF _Toc23993 3 HYPERLINK

2、l _Toc22674 2.1 試驗(yàn)材料 PAGEREF _Toc22674 3 HYPERLINK l _Toc215 2.1.1 試驗(yàn)器材 PAGEREF _Toc215 3 HYPERLINK l _Toc9416 2.1.2 試驗(yàn)藥品 PAGEREF _Toc9416 4 HYPERLINK l _Toc27943 2.1.3菌種來源 PAGEREF _Toc27943 4 HYPERLINK l _Toc6185 2.2試驗(yàn)方法 PAGEREF _Toc6185 4 HYPERLINK l _Toc26805 2.2.1培養(yǎng)基配備 PAGEREF _Toc26805 4 HYPERL

3、INK l _Toc10375 2.2.2取樣 PAGEREF _Toc10375 5 HYPERLINK l _Toc8737 2.2.3接種 PAGEREF _Toc8737 5 HYPERLINK l _Toc25038 2.2.4 革蘭氏染色 PAGEREF _Toc25038 5 HYPERLINK l _Toc22090 2.2.5腸桿菌生化鑒定試驗(yàn) PAGEREF _Toc22090 6 HYPERLINK l _Toc29563 2.2.6用腸道侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清 PAGEREF _Toc29563 6 HYPERLINK l _Toc11369 2.2.7藥敏試驗(yàn) P

4、AGEREF _Toc11369 7 HYPERLINK l _Toc3790 3 結(jié)果 PAGEREF _Toc3790 7 HYPERLINK l _Toc17409 3.1 接種三例病豬菌落的生長結(jié)果 PAGEREF _Toc17409 7 HYPERLINK l _Toc17274 3.2革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果 PAGEREF _Toc17274 9 HYPERLINK l _Toc2888 3.3大腸桿菌生化鑒定管變色結(jié)果 PAGEREF _Toc2888 9 HYPERLINK l _Toc14048 3.4腸道侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清結(jié)果 PAGEREF _Toc14048 10

5、HYPERLINK l _Toc27137 3.5藥敏試驗(yàn)大腸桿菌的生長結(jié)果 PAGEREF _Toc27137 11 HYPERLINK l _Toc12824 4 小結(jié)與討論 PAGEREF _Toc12824 12 HYPERLINK l _Toc27600 參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc27600 13 HYPERLINK l _Toc9562 致謝 PAGEREF _Toc9562 14 HYPERLINK l _Toc11929 附錄 PAGEREF _Toc11929 16桃源豬場育肥豬大腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性研究摘 要為了調(diào)查桃源地區(qū)豬致病性大腸桿菌的流行血清型及耐藥

6、性，篩選抑菌性能強(qiáng)的藥物，本試驗(yàn)對桃源豬場的病豬進(jìn)行取樣，通過菌種培養(yǎng)、分離、純化、革蘭氏染色、腸桿菌生化鑒定試驗(yàn)、血清型鑒定試驗(yàn)以及藥敏性試驗(yàn)，分離并鑒定大腸桿菌，篩選出對大腸桿菌敏感的藥物。結(jié)果表明，分離的豬致病性大腸桿菌血清型為O144：K，該血清型占菌株的66.6%。分離出的大腸桿菌對奧復(fù)星、復(fù)達(dá)欣、頭孢曲松、丁胺卡那霉素四種藥物敏感，對麥迪霉素、氨芐西林兩種藥物中度敏感。對頭孢呋辛、萬古霉素、諾氟沙星、多黏霉素B、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、慶大霉素、先鋒、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、卡那霉素、新霉素、美滿霉素等13中藥物耐藥，建議該豬場用奧復(fù)星、復(fù)達(dá)欣、頭孢曲松、丁胺卡那霉素等四種藥物進(jìn)行治療效果

7、較好。關(guān)鍵詞：育肥豬；大腸桿菌；分離鑒定；藥物敏感性StudyonIsolationandIdentificationandDrugSensitivityofEscherichiaColiinTaoyuanPigFatteningPigsAbstractInordertoinvestigateepidemicserotypeanddrugresistanceofSwinePathogenicEscherichiacoliinTaoyuanareaandscreenedtheantibacterialpropertiesofthedrug,theexperimentalareaofChangde

8、Taoyuanpigfarmpigsbysampling,separationandpurificationofthebacteria,Gramstaining,biochemicaltest,Escherichiacoliserotypeidentificationanddrugsensitivitytestoftheselectedsensitivedrugresistanceofpathogens.Theresultsshowthat,theseparationofporcinepathogenicEscherichiacoliserotypesO144:K,serotypeofpath

9、ogenicstrainsaccountedfor66.6%.TheisolatedEscherichiacolitoofloxacin,FuDaxin,ceftriaxone,amikacinfourpillsasensitivetokanamycin,ampicillin,Maddietwopillsamoderatesensitivity.Tocefuroxime,vancomycin,norfloxacin,kanamycinB,viscosityofcompoundsulfamethoxazole,ciprofloxacin,gentamicin,tetracycline,doxyc

10、ycline,pioneer,kanamycin,neomycin,doxycyclinetabletsresistance13.Key words: Pig; Escherichiacoli; Isolation and Identification;DrugSensitivity 1 引 言大腸桿菌的分類地位為細(xì)菌界（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、Y-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌屬（Escherichia）、大腸桿菌（E.coli

11、）。大腸桿菌為革蘭氏陰性比較短小的桿菌,大小為0.4-0.72-3 m,兩端鈍圓,多散在或成對存在,無芽胞,多數(shù)有周身鞭毛,少數(shù)有莢膜,不形成芽孢,大多有菌毛,具有運(yùn)動能力。為需氧或兼性厭氧菌,最適培養(yǎng)溫度為37,最適生長PH值為7.2-7.41。大腸桿菌是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)一段時間內(nèi)，認(rèn)為是非致病菌。該菌大多數(shù)存在于人和動物的腸道內(nèi),并伴隨類便排出體外,作為正常菌群存在,不引起致病,人們常常忽略它的存在。直到20世紀(jì)中葉才發(fā)現(xiàn)一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥2-3。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種急性傳染病。病豬表現(xiàn)排便次數(shù)

12、明顯增多，糞便稀薄如水樣或稀粥樣。由細(xì)菌引起豬腹瀉較常見，豬的腸道內(nèi)有大量潛在的致病菌，但不是每種細(xì)菌都與臨床疾病有明確的聯(lián)系4。由于病原性大腸桿菌的血清型不同和豬的年齡、生理機(jī)能和免疫狀態(tài)等差異，引起的疾病可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病三種5。主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。本病在世界各地均有發(fā)生，在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)造成豬的大批死亡或生長發(fā)育不良，成為養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重障礙6-7。近年來，大腸桿菌耐藥率不斷提高，出現(xiàn)了一種細(xì)菌耐多種藥物的情況，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是21世紀(jì)最大的公共衛(wèi)生問題之一。原因是豬大腸桿菌病流行趨勢、臨床癥狀和病理變化不一，常與其他細(xì)菌、病毒等混合感染8。特別是抗菌

13、藥物的嚴(yán)重不合理使用，促使多重耐藥性的出現(xiàn)，使得獸醫(yī)臨床對大腸桿菌的防治變得十分困難9-10。豬鏈球菌帶來的危害給我們敲響了警鐘，超級細(xì)菌給我們的生活增添了危害。如何減少細(xì)菌耐藥性，已經(jīng)成為人們越來越關(guān)心的話題。著眼于目前養(yǎng)殖行業(yè)的實(shí)際情況，新獸藥的研發(fā)和合理用藥是解決目前問題的關(guān)鍵。但是獸藥研發(fā)周期長，合理用藥是目前最適合的方法，其中聯(lián)合用藥是解決細(xì)菌耐藥性的有效方法。本試驗(yàn)菌種取自桃源地區(qū)斗姆湖豬場，通過菌種的分離純化、革蘭氏染色、腸桿菌生化鑒定試驗(yàn)、血清型鑒定試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)，篩選對大腸桿菌敏感藥物，為該豬場豬大腸桿菌病的治療提供臨床用藥參考，提高養(yǎng)豬效益。2 材料和方法2.1 試驗(yàn)材料

14、2.1.1 試驗(yàn)器材試驗(yàn)器材：高壓滅菌鍋LDZX-40BI型，超凈工作臺SW-CJ-IF，恒溫箱303A3-3型，普通光學(xué)顯微鏡XS-212-20型，精密電子天平MP200A，微量移液器WKY型（200-1000 ul和100-500 ul），生物顯微鏡，電爐，微波爐，試管，培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，玻璃棒，酒精燈，錐形瓶，棉簽，鑷子，刮鏟，打火機(jī)等。2.1.2 試驗(yàn)藥品試驗(yàn)藥品a：牛肉膏，蛋白胨，無菌水，蒸餾水，消毒液。瓊脂、伊紅美藍(lán)（EMB）、SS培養(yǎng)基由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。腸桿菌細(xì)菌生化鑒定管由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。香柏油由中國上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn)。NaCl、氫氧化鈉、95酒

15、精、結(jié)晶紫、碘液、番紅等由微生物實(shí)驗(yàn)室配制。試驗(yàn)藥品b：奧復(fù)星（奧） 萬古霉素（萬） 麥迪霉素（麥） 復(fù)達(dá)欣（達(dá)） 先鋒霉素（） 頭孢呋辛（西） 四環(huán)素（四） 多黏霉素B（多） 復(fù)方新諾明（復(fù)） 美滿霉素（滿） 丙氟哌酸（環(huán)） 慶大霉素（慶） 諾氟沙星（氟） 頭孢曲松（菌） 強(qiáng)力霉素（強(qiáng)） 丁胺卡那霉素（卡） 氨芐西林(氨) 卡那霉素（卡） 新霉素（新）。由杭州天和微生物試劑有限公司采用美國NCCLS最新藥敏試驗(yàn)法規(guī)配制。2.1.3菌種來源本試驗(yàn)的菌種是由湖南省常德市惠生肉類公司的桃源豬場采集而來2.2試驗(yàn)方法2.2.1培養(yǎng)基配備配備營養(yǎng)培養(yǎng)基:稱取2.5 g牛肉膏、5.0 g蛋白胨、2.5

16、gNaCl，用玻璃棒進(jìn)行攪拌，加入蒸餾水補(bǔ)足至500 ml。然后用玻璃棒沾少許液體，用pH試紙測定pH值，用NaOH或HCL調(diào)制pH7.0.配制成500 ml的營養(yǎng)培養(yǎng)基分裝入若干個錐形瓶中。配備瓊脂培養(yǎng)基：稱取5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 gNaCl、20.0 g瓊脂，加蒸餾水補(bǔ)足至1000 ml。調(diào)pH值，配制成1000 ml瓊脂培養(yǎng)基分裝入若干錐形瓶中。配備伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：稱取2.88 g伊紅美藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足至80 ml伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，調(diào)pH值，裝瓶。將上述配好裝瓶的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121滅菌30分鐘。2.2.2取樣換上生化防護(hù)服，帶好口罩，拿好取樣工具，進(jìn)

17、入豬舍。在豬舍管理員的幫助下順利取樣。取樣時，抓住耳朵，牽住尾巴，用準(zhǔn)備好的無菌棉簽在豬直腸口輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭幾下，放入事先準(zhǔn)備好的肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。帶回實(shí)驗(yàn)室放入37生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，取樣情況如下： 病豬：育肥豬 體重約100千克左右，有糞便拉稀癥狀，進(jìn)食、體溫等一切正常。 病豬: 育肥豬 體重約85千克左右，同樣有糞便拉稀癥狀，進(jìn)食、體溫正常。 病豬: 育肥豬 體重約40千克左右，一進(jìn)食就會嘔吐，無糞便拉稀癥狀，進(jìn)食、體溫一切正常。2.2.3接種 a:打開超凈工作臺電源，再打開紫外滅菌燈15分鐘。 b:首先配制SS培養(yǎng)基，稱取3.92 gSS培養(yǎng)基放入燒杯中，加蒸餾水至70 ml， 用玻璃

18、棒攪勻，在電爐上加熱溶解沸騰。 c:再用微波爐溶解已經(jīng)配制好的瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。 d:點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球?qū)⑹植潦酶蓛簟Ｈ【艂€滅菌的培養(yǎng)皿，在超凈工作臺中分別澆3個SS培養(yǎng)基，3個瓊脂培養(yǎng)基，3個伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。待其凝固，用標(biāo)簽紙在皿蓋的一側(cè)做好標(biāo)記。 e:將接種環(huán)在酒精燈外焰上灼燒滅菌、冷卻，分別取菌在凝固的培養(yǎng)基上劃線接種。 f:將接好種的培養(yǎng)皿倒平板，放入37生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。2.2.4 革蘭氏染色將試驗(yàn)所需的器具、試劑放在超凈工作臺上滅菌。主要過程如下涂片：用消毒棉球擦拭雙手，用鑷子取干凈載玻片一塊，在載玻片的左右兩端各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，涂在左邊做

19、成濃菌液。再用滅菌的接種環(huán)挑剛制成的濃菌液涂在右邊制成薄的涂片。晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方用文火烘干。固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定，以不燙手為宜。結(jié)晶紫初染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量的結(jié)晶紫染色液染色1 min，以蓋滿細(xì)菌涂面為宜。之后傾去染色液，用水小心的沖洗。碘液媒染：滴加碘液，媒染1 min后用水洗去碘液。脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95乙醇，脫色20-25 s至流出液無色，立即水洗。復(fù)染：滴加番紅復(fù)染2-5 min，然后用水洗去涂片上的番紅染色液。晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀

20、察，進(jìn)行判斷2.2.5腸桿菌生化鑒定試驗(yàn) 打開超凈工作臺電源以及紫外滅菌燈開關(guān)，將試驗(yàn)所需的器具、試劑放在超凈工作臺上滅菌。用酒精棉球消毒雙手，點(diǎn)然酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈外焰上滅菌冷卻后。然后取病豬和病豬的中分離的大腸桿菌放入兩組生化鑒定管中，攪拌均勻，靜置24小時。2.2.6用腸道侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清 準(zhǔn)備好11塊滅菌的載玻片于超凈工作臺，打開超凈工作臺電源，再打開紫外滅菌燈15分鐘。每塊玻片上滴加三滴診斷血清的試劑，標(biāo)記為A B C。用移液槍取三例病豬中分離出的大腸桿菌各滴一滴在一塊玻片上以此類推到11塊。將菌液與試劑混合均勻后，靜止一會觀察現(xiàn)象。2.2.7藥敏試驗(yàn)打開超凈工作臺電

21、源，再打開紫外滅菌燈15分鐘。點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球擦拭雙手。準(zhǔn)備好三個滅好菌的大培養(yǎng)皿做好標(biāo)記，澆上瓊脂待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍分別吸取100 L培養(yǎng)了24小時的菌液。分別在三個大培養(yǎng)皿中各滴4-6滴菌液，用刮鏟刮至均勻。然后開始貼藥片，藥片之間間隔要大于2厘米，共19種藥片。最后倒平板，放入37恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)24小時。表1為抗菌藥紙片種類、含藥量及判定標(biāo)準(zhǔn)。表1抗菌藥紙片種類、含藥量及判定標(biāo)準(zhǔn)11Antibacterialpapertypes,includingquantityanddecisioncriteria抗菌藥 紙片含藥量（mg/片）判定標(biāo)準(zhǔn)(抑菌環(huán)直徑mm)耐藥中度敏感敏 感氨

22、芐西林10 121316 17 復(fù)達(dá)欣30 14151718 頭孢呋辛30 14151718 頭孢曲松30 13142021萬古霉素309101112諾氟沙星10 121316 17多黏霉素B 丁胺卡拉30 141516 17復(fù)方新諾明23.75/1.25 101115 16丙氟哌酸 慶大霉素10 121314 15麥迪霉素先鋒v30 141517 18四環(huán)素30 141518 19強(qiáng)力霉素30121317（15）18（16）美滿霉素3 試驗(yàn)結(jié)果3.1 接種三例病豬菌落的生長結(jié)果 表2為病豬分離菌的生長情況。表2 病豬的生長結(jié)果 單位mmTable 2 Sickpigs(1)thegrowth

23、oftheresults Theunitofmm 培養(yǎng)基直徑大小表面形態(tài)邊緣干濕顏色光澤透明度普通培養(yǎng)基a5扁平完整濕潤無色無光澤透明普通培養(yǎng)基b3.5凸透鏡狀完整濕潤白色無光澤不透明普通培養(yǎng)基c1凸透鏡狀完整濕潤白色無光澤不透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基a0.8隆起完整濕潤紫黑色有金屬光澤不透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基b1.5凸透鏡狀完整濕潤白色無光澤不透明SS培養(yǎng)基a0.8凸透鏡狀完整濕潤粉紅色無光澤不透明SS培養(yǎng)基b1.5隆起完整濕潤中間黑色無光澤邊緣透明表3為病豬分離菌的生長情況。表3 病豬的生長結(jié)果 單位mmTable 3 Sickpigs(2)thegrowthoftheresults Theunito

24、fmm 培養(yǎng)基直徑大小表面形態(tài)邊緣干濕顏色光澤透明度普通培養(yǎng)基a6隆起完整濕潤白色無光澤不透明普通培養(yǎng)基b4.5扁平完整濕潤無色無光澤透明普通培養(yǎng)基c0.9凸透鏡狀完整濕潤白色無光澤不透明普通培養(yǎng)基a3.5扁平不規(guī)則濕潤無色無光澤透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基a1.5隆起完整濕潤紫黑色有金屬光澤不透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基b6.2扁平完整濕潤白色無光澤不透明SS培養(yǎng)基a1.7凸透鏡狀完整濕潤中間為黑色無光澤邊緣透明SS培養(yǎng)基b0.7凸透鏡狀完整濕潤粉紅色無光澤不透明表4為病豬分離菌的生長情況。表4 病豬的生長結(jié)果 單位mmTable 4 Sickpigs(3)thegrowthoftheresults Theun

25、itofmm 培養(yǎng)基直徑大小表面形態(tài)邊緣干濕顏色光澤透明度普通培養(yǎng)基a3凸透鏡狀完整濕潤白色無光澤不透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基a1.3隆起完整濕潤紫黑色有金屬光澤不透明伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基b3.3凸透鏡狀完整濕潤中間為黑色無光澤邊緣透明SS培養(yǎng)基a0.5凸透鏡狀完整濕潤中間為黑色無光澤邊緣透明SS培養(yǎng)基b0.8凸透鏡狀完整濕潤粉紅色無光澤不透明注：上表中a,b,c,為菌落個數(shù)。以上生長結(jié)果可以判斷普通培養(yǎng)基的伴有糞臭味濕潤的白色菌落、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的有金屬光澤的菌落、SS培養(yǎng)基的粉紅色菌落伴為大腸桿菌，而SS培養(yǎng)基上邊緣透明中間黑色的菌落為沙門氏菌。3.2革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果 分離菌經(jīng)涂片，革蘭氏染色、在顯微

26、鏡油鏡下觀察到如下圖。中等大小、無芽孢、單個或多個排列、形態(tài)較為一致、兩端鈍圓的紅色菌落，由此可判斷該菌落為大腸桿菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，通過革蘭氏染色會呈紅色。圖1 豬大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果3.3大腸桿菌生化鑒定管變色結(jié)果表5為病豬、病豬體內(nèi)分離出的大腸桿菌的生化鑒定管變色結(jié)果。表5生化鑒定管變色結(jié)果Table 5tubecolorbiochemicalidentification種類原顏色病豬病豬葡萄糖絳紫色黃色黃色賴氨酸土棕色深紫色深紫色鳥氨酸土棕色深紫色深紫色硫化氫米黃色黑灰色（產(chǎn)氣）黑灰色（產(chǎn)氣）靛基質(zhì)米黃色（略淡硫化氫）乳白色乳白色乳糖紫色黃色黃色衛(wèi)矛醇紫色灰綠色灰綠色苯丙氨酸

27、米黃色乳白色乳白色（產(chǎn)氣）尿素桃紅色桃紅色桃紅色構(gòu)櫞酸鹽綠色深綠色深綠色（有褐色沉淀物）氨對土棕色深紫色藍(lán)紫色 根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，大腸桿菌能發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)酸產(chǎn)氣，如可迅速分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖等多種碳酸化合物，約半數(shù)菌株不分解蔗糖。還原硝酸鹽，產(chǎn)生靛基質(zhì)，幾乎不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素。除乳糖發(fā)酵試驗(yàn)外，吲哚形成試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)、VP 試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用等 4 項試驗(yàn)（IMVIC 試驗(yàn)）是衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)中常用的檢測指標(biāo)。該菌的11項生化鑒定結(jié)果均與大腸桿菌相符，同時結(jié)合病癥、菌落培養(yǎng)特性及菌體特性，確定該分離菌為大腸桿菌12。3.4腸道侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清結(jié)果表6為從病豬、病豬

28、、病豬體內(nèi)分離出的大腸桿菌血清診斷結(jié)果。表6 血清診斷結(jié)果Table 6 serodiagnosis 藥品病豬病豬病豬OK多價1O28：K73O29：K？O112：K66O124：K72OK多價2O136：K78O143：K?O144：KO152：K?O164：K?注：上表中“”表示凝集，“”表示不凝集。結(jié)果表明，分離純化的豬致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O144：K，這種血清型占致病菌株的66.6%。3.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果 表7為從病豬、病豬、病豬體內(nèi)分離的大腸桿菌分別培養(yǎng)在號大培養(yǎng)皿、號大培養(yǎng)皿、號大培養(yǎng)皿中，分別往大培養(yǎng)皿中貼上19種藥片。在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后大培養(yǎng)皿中的無菌落帶的范圍。

29、表7藥敏試驗(yàn)結(jié)果單位mm （寬-長）Table 7 Bigpetridishcolonydiameterresults Theunitofmm (wide-long)號大培養(yǎng)皿號大培養(yǎng)皿號大培養(yǎng)皿奧復(fù)星長方形菌落13.0-24.0萬古霉素麥迪霉素長方形菌落3.5-19.3 復(fù)達(dá)欣21.0不規(guī)則無菌帶27.7先鋒霉素頭孢呋辛11.0四環(huán)素不規(guī)則無菌帶多黏霉素B13.1復(fù)方新諾明美滿霉素9.2丙氟哌酸9.0慶大霉素諾氟沙星頭孢曲松22.031.0強(qiáng)力霉素丁胺卡那霉素10.0長方形菌落4.7-11.617.0氨芐西林長方形菌落4.1-23.0卡那霉素6.0新霉素7.0注：上表中 “”表示無明顯抑菌圈

30、。對照表1可得出大腸桿菌對奧復(fù)星、復(fù)達(dá)欣、頭孢曲松、丁胺卡那霉素四種藥片敏感，對麥迪霉素、氨芐西林兩種藥片中度敏感。對頭孢呋辛、萬古霉素、諾氟沙星、多黏霉素B、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、慶大霉素、先鋒、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、卡那霉素、新霉素、美滿霉素等13中藥片耐藥。4 小結(jié)與討論以上試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的豬致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O144：K，這種血清型占菌株的66.6%。分離出的大腸桿菌對奧復(fù)星、復(fù)達(dá)欣、頭孢曲松、丁胺卡那霉素四種藥片敏感，對麥迪霉素、氨芐西林兩種藥片中度敏感。對頭孢呋辛、萬古霉素、諾氟沙星、多黏霉素B、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、慶大霉素、先鋒、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、卡那霉素、新霉素、美滿

31、霉素等13種藥片耐藥。對于培養(yǎng)皿中的不規(guī)則抑菌圈可能是由于貼藥片時操作不當(dāng)所造成的。通過本次試驗(yàn)，我們可以快速有效的檢測出大腸桿菌對各種抗菌藥的敏感性，指導(dǎo)臨床合理用藥。因?yàn)橥患?xì)菌的不同菌株對不同抗菌藥的敏感性也有差異。進(jìn)行有效的藥敏試驗(yàn)可以及時掌握各種新型菌種和菌株的耐藥性，同時采取相應(yīng)的措施。這樣不僅不會延誤病情還不會浪費(fèi)藥物。并且該試驗(yàn)是在體外對已經(jīng)分離的大腸桿菌進(jìn)行藥敏，目的明確，操作相對簡單，成本相對降低。是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。抗菌藥物經(jīng)過十幾年的使用，世界各地對由于抗菌藥物濫用而引起的大腸桿菌耐藥性問題的重視程度日益提高，養(yǎng)殖場為了保證動物的健康生長而使用的各類抗菌藥物，其中

32、有一部分殘留的抗菌藥物在動物體內(nèi)蓄積，另一部分對環(huán)境中的大腸桿菌形成藥物壓力而導(dǎo)致耐藥菌株的大量出現(xiàn)，加快了耐藥基因的傳播速度，對環(huán)境、人體的污染越來越嚴(yán)重，耐藥性污染的嚴(yán)重性導(dǎo)致常規(guī)抗菌藥物已經(jīng)不能起到很好的療效甚至失效，尋求綠色無污染的新型抗菌藥物并控制藥物濫用是當(dāng)前的主要話題。大腸桿菌作為耐藥因子的重要攜帶菌和傳播菌，因此檢測分析大腸桿菌的耐藥性變化對于人類和生態(tài)環(huán)境有著極為重要的意義。就目前對抗菌藥物耐藥性的研究來看，大腸桿菌對各類抗菌藥的耐藥性檢出呈增長態(tài)勢13。該地區(qū)育肥豬體內(nèi)的大腸桿菌已經(jīng)對大多數(shù)藥物產(chǎn)生耐藥性，因此該豬場在臨床用藥上要首選復(fù)達(dá)欣、丁胺卡那霉素、頭孢曲松、奧復(fù)星等

33、藥物治療能達(dá)到較好的效果。并且，嘔吐豬中含有沙門氏菌等其它菌種。此外，要避免同一藥物連續(xù)使用，要采取“輪換”或“交替”的用藥方案，同時藥物劑量要充足，可在發(fā)病日齡前 1-2d 進(jìn)行預(yù)防性投藥，或發(fā)病后做緊急治療。對由大腸桿菌引起的豬腹瀉，應(yīng)采取以加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、選擇與本場治病菌血清型一致的抗菌藥物或用本場致病菌制備自家菌苗進(jìn)行免疫，應(yīng)用有效的抗菌藥物預(yù)防或治療為主的綜合性防疫措施，才能取得良好的效果14。育肥豬大腸桿菌病跟其他動物大腸桿菌病一樣，也是一種條件性疾病本病的流行雖無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，但尤以冬末春初和氣溫多變季節(jié)多發(fā)。本病的流行大多呈地方性流行或散發(fā)。如果豬舍飼養(yǎng)密度大，

34、通風(fēng)換氣不良，場地不整潔，潮濕，擁擠，環(huán)境污染嚴(yán)重，衛(wèi)生條件差及受應(yīng)激因素影響，本病則可隨時發(fā)生。本病最主要的防治措施是搞好豬舍環(huán)境衛(wèi)生，改善飼養(yǎng)管理管理條件，保持營養(yǎng)平衡，保證飼料、墊料、飲水無污染，降低豬舍內(nèi)氨氣等有害氣體的濃度和塵埃，由專人負(fù)責(zé)，搞好清潔衛(wèi)生和消毒工作，及時淘汰處理病豬，盡量保持環(huán)境安靜，有利于防止大腸桿菌病的發(fā)生15。此外場址應(yīng)建在地勢高燥、水源充足、水質(zhì)良好、排水方便、遠(yuǎn)離居民區(qū)和其他禽場、屠宰或畜產(chǎn)品加工廠。參考文獻(xiàn)1 張茹.豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定及雙基因缺失突變株構(gòu)建D,武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.2杜冬冬. 一株豬源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析D,山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.3李不學(xué),王建鋒，,杜軍,等.致仔豬腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)B.當(dāng)代畜牧,2013，16-18.4李淑紅,王京仁,洪冬勝,等.犬腹瀉病原菌的分離鑒