1、細(xì)胞學(xué)檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)輻射生物學(xué)研究方法細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)The Clonogenic Assay克隆實(shí)驗(yàn)最早是細(xì)菌物學(xué)家用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌存活的一種實(shí)驗(yàn)手段。Puck和Marcus將此方法引入到細(xì)胞生物學(xué)中單個(gè)細(xì)胞在petri dish中生長(zhǎng)并形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的克隆輻射生物學(xué)研究方法細(xì)胞細(xì)胞輻照受損傷未受損傷克隆克隆細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)The Clonogenic Assay輻射生物學(xué)研究方法細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)The Clonogenic Assay輻射生物學(xué)研究方法5細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)The Clonogenic Assay輻射生物學(xué)研究方法7細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)MTT Assay輻射生物學(xué)研究方法MTT（3-(4，5)-di

2、methylthiahiazo (-z-yl)-3，5-di- phenytetrazoliumromide ），又名噻唑藍(lán)MTT琥珀酸脫氫酶黃色甲臜 藍(lán)紫色結(jié)晶DMSO溶解后570nm測(cè)OD值MTT一種黃色化合物，能接受氫離子的染料。在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)色的甲臜（formazan）結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）MTT工作液制備（5mg/ml）：MTT粉末+PBS0.22m濾膜過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，4 避光保存 吸取待測(cè)細(xì)胞的原培養(yǎng)基，按一定比例（一般為0.5%MTT）加入新鮮培養(yǎng)

3、基和MTT工作液，37 繼續(xù)培養(yǎng)4h吸取培養(yǎng)基與MTT混合物，加入DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶酶標(biāo)儀570nm出測(cè)定OD值8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)MTT Assay輻射生物學(xué)研究方法Clonogenic Assay MTT細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)MTT Assay輻射生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞術(shù)（ Flow Cytometry ）FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)FALS SensorLaser輻射生物學(xué)研究方法 流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選

4、。 細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量輻射生物學(xué)研究方法Injector Tip熒光信號(hào)激光束Sheath fluid樣品流和鞘流液流系統(tǒng)輻射生物學(xué)研究方法流動(dòng)室Laser Flow Cell孔徑50-200m 檢測(cè)區(qū)離噴口200m有分選功能 輻射生物學(xué)研究方法細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核-特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA, RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子, PH值, 膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性輻射生物學(xué)研究方法熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)

5、選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線(xiàn)性放大器和對(duì)數(shù)放大器熒光測(cè)量輻射生物學(xué)研究方法熒光測(cè)量輻射生物學(xué)研究方法FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類(lèi)幾種常見(jiàn)的熒光染料輻射生物學(xué)研究方法熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)（nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（nm) 顏色FITC 488 525 深藍(lán)色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色P

6、I 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色幾種常見(jiàn)的熒光染料輻射生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)相原理：細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4CPI（Propidium Iodide ）：一種溴化乙啶的類(lèi)似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光 。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535 nm和615 nm 利用PI標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比輻射生物學(xué)研究方法流式分析細(xì)胞周期時(shí)相分布輻射生物學(xué)研究方法細(xì)胞實(shí)時(shí)攝像技術(shù)輻射生物學(xué)研究方法優(yōu)點(diǎn)：可以得到準(zhǔn)確

7、的細(xì)胞周期時(shí)間及分裂間 期和分裂期的準(zhǔn)確時(shí)間缺點(diǎn)：缺乏對(duì)細(xì)胞群體的指征性細(xì)胞實(shí)時(shí)攝像技術(shù)輻射生物學(xué)研究方法堿基變化 脫氧核糖變化DNA鏈斷裂 單鏈斷裂（SSB） 雙鏈斷裂（DSB）交聯(lián) DNA鏈交聯(lián) DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián) 其中DSB是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)中最重要的原初損傷，而非重接性的DSB則被認(rèn)為是細(xì)胞殺傷效應(yīng)的最重要的損傷電離輻射致DNA分子的變化輻射生物學(xué)研究方法DNA鏈斷裂示意圖單鏈斷裂雙鏈斷裂單鏈斷裂：是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈斷裂雙鏈斷裂：是DNA的兩條互補(bǔ)鏈于同一對(duì)應(yīng)處或相鄰處同時(shí)斷裂輻射生物學(xué)研究方法凝膠電泳原理：DNA帶負(fù)電，外加電場(chǎng)后，DNA片段會(huì)在凝膠中移動(dòng)且移動(dòng)的速度跟片段

8、大小有關(guān)步驟：制膠 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察DNA分子種類(lèi)線(xiàn)狀DNA單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成ds-DNA，造成遷移距離不確定環(huán)狀DNA單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 線(xiàn)狀ds-DNA電泳使用頻率最高的一種電泳環(huán)狀ds-DNA電泳: 常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定線(xiàn)狀ss-DNA電泳輻射生物學(xué)研究方法單細(xì)胞凝膠電泳或彗星試驗(yàn)原理：由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又經(jīng)Singh N P和Olive P I進(jìn)一步完善的一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷與修復(fù)的方法。因其細(xì)胞電泳形狀頗似彗星，又稱(chēng)彗星試驗(yàn)(comet assay)。它是一種測(cè)定和研究單

9、個(gè)細(xì)胞DNA鏈斷裂的新電泳技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣品量少、無(wú)需放射性標(biāo)記，具有極高的實(shí)用價(jià)值。目前該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)、體外各種有核細(xì)胞經(jīng)受試物誘導(dǎo)的DNA損傷和修復(fù)的研究 輻射生物學(xué)研究方法輻射生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)步驟輻射生物學(xué)研究方法輻射生物學(xué)研究方法定義：微核(Micronucleus)的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱(chēng)微核微核試驗(yàn)(Micronucleus test，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試

10、驗(yàn)。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑微核試驗(yàn)輻射生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞質(zhì)中微核來(lái)源：斷片或無(wú)著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物的作用使個(gè)別染色體或帶苔絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。輻射生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)步驟37輻射生物學(xué)研究方法統(tǒng)計(jì)1000個(gè)以上雙核細(xì)胞內(nèi)含有微核的細(xì)胞占的比例 含有微核的雙核細(xì)胞數(shù) 微核率= 1000 含有雙核細(xì)胞的總數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)輻射生物學(xué)研究方法MNNCE輻射生物學(xué)研究方法簡(jiǎn)介：熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜

11、交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光染料. 熒光原位雜交（FISH）輻射生物學(xué)研究方法原理：用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線(xiàn)性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色

12、等特點(diǎn)41輻射生物學(xué)研究方法根據(jù)所用的探針和靶核酸的不同可分為三類(lèi)： DNA-DNA雜交； DNA-RNA雜交； RNA-RNA雜交。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否能直接被檢測(cè)可分為兩類(lèi)： 直接法：探針用放射性同位素、熒光素或一些酶標(biāo)記，當(dāng)與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸形成雜交體后，可分別通過(guò)放射性自顯影、成色的酶促反應(yīng)、熒光等來(lái)顯示靶核酸的位置。 間接法：一般都是用半抗原來(lái)標(biāo)記探針，如生物素、地高辛等，然后通過(guò)用免疫組織化學(xué)對(duì)半抗原的定位，間接地顯示探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體。輻射生物學(xué)研究方法探針及標(biāo)本的變性：DNA變性成單鏈雜交：探針與待測(cè)樣本充分結(jié)合洗脫：洗去未結(jié)合探針雜交信號(hào)的放大封片：延長(zhǎng)保存

13、時(shí)間熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果實(shí)驗(yàn)步驟輻射生物學(xué)研究方法整條染色體涂染通過(guò)整條染色體涂染判斷易位染色體輻射生物學(xué)研究方法熒光染色檢測(cè)DSB原理：DSB產(chǎn)生時(shí)，會(huì)有特異性蛋白53BP1以及-H2AX 產(chǎn)生，利用這兩種蛋白的抗體進(jìn)行原位免疫熒光染色，通過(guò)熒光顯微成像術(shù)獲得細(xì)胞及特征蛋白的熒光圖像后,分析圖像中陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)評(píng)估旁細(xì)胞的損傷程度 輻射生物學(xué)研究方法輻射生物學(xué)研究方法輻射生物學(xué)研究方法概念:兩個(gè)不同來(lái)源的、含有互補(bǔ)核苷酸順序的單股核酸分子，通過(guò)堿基配對(duì)形成一個(gè)新的、穩(wěn)定的雙股分子的過(guò)程原理:核酸經(jīng)加熱變性后，低于變性溫度20-30時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中加入的核酸探針與待測(cè)核酸樣品中具有互補(bǔ)序

14、列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)即可檢測(cè)特定的核苷酸片段核酸雜交技術(shù)輻射生物學(xué)研究方法核酸雜交原理圖輻射生物學(xué)研究方法根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)分： 放射性標(biāo)記: 32P,35S,125I, 3H 非放射性標(biāo)記：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記等敏感度高，半衰期短（32P 14.3天，35S 87.1天，125I 60天，3H的半衰期長(zhǎng)達(dá)12.3年，但它所釋放放射線(xiàn)能量太低，只能用于組織原位雜交），有輻射危害探針的分類(lèi)輻射生物學(xué)研究方法探針的分類(lèi)根據(jù)探針中核酸的性質(zhì)分：DNA(包括cDNA) 探針RNA探針(包括cRNA) 寡核苷酸探針肽核酸（peptide nucleic acid,

15、 PNA）探針輻射生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)步驟輻射生物學(xué)研究方法核酸限制性?xún)?nèi)切酶原理：限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA輻射生物學(xué)研究方法四類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及產(chǎn)物輻射生物學(xué)研究方法DNA 1g反應(yīng) 10緩沖液2L重蒸水19L1L酶液+用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，37水浴保溫2-3h每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，電泳檢測(cè)EP管編號(hào), 加樣實(shí)驗(yàn)步驟輻射生物學(xué)研究方法 Southern Blotting Northern Blotting輻射生物學(xué)研究方法Southern

16、Blotting膜上檢測(cè)DNA的雜交技術(shù)，1975年由Edwin Southern建立。將待測(cè)DNA序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針?lè)肿舆M(jìn)行雜交的過(guò)程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法輻射生物學(xué)研究方法印跡方法虹吸印跡法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法輻射生物學(xué)研究方法虹吸轉(zhuǎn)移法利用毛細(xì)管的虹吸作用由移動(dòng)緩沖液帶動(dòng)核酸分子轉(zhuǎn)移至濾膜上輻射生物學(xué)研究方法利用真空泵將轉(zhuǎn)移緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核算分子快速轉(zhuǎn)移到凝膠下面的濾膜上。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是快速，轉(zhuǎn)膜的同時(shí)進(jìn)行DNA的變性和中和，整個(gè)過(guò)程只需1h左右真空轉(zhuǎn)移法輻射生物學(xué)研究方法電轉(zhuǎn)移法輻射生物學(xué)研究方法實(shí)

17、驗(yàn)步驟核酸的制備電泳印跡預(yù)雜交雜交洗膜檢測(cè)輻射生物學(xué)研究方法Northern BlottingNorthern Blotting是將RNA樣品變性和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。其基本原理與Southern Blotting相同，只不過(guò)變性方法不能采用堿變性法（堿會(huì)導(dǎo)致RNA水解），一般采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛等變性法。主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或者mRNA分子的大小輻射生物學(xué)研究方法原理，方法及步驟與Southern Blotting類(lèi)似Northern Blotting輻射生物學(xué)研究方法定義

18、：是通過(guò)模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的方式，在體外選擇性地將 DNA 某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)，由美國(guó)科學(xué)家Kary B. Mullis提出原理：PCR技術(shù)是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）存在的條件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，經(jīng)過(guò)DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸的循環(huán)過(guò)程，體外大量擴(kuò)增特異DNA片段PCR定義及原理輻射生物學(xué)研究方法PCR反應(yīng)混合物 引 物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase（UNG酶） 和 或 和輻射生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)步驟引物設(shè)計(jì)與合成

19、DNA模板的變性模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）引物延伸以上為一次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸），新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板輻射生物學(xué)研究方法逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的PCR，可對(duì)基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析輻射生物學(xué)研究方法原理：通過(guò)特定設(shè)計(jì)的PCR儀器來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱(chēng)為實(shí)時(shí)定量PCR熒光標(biāo)記方式Quantitative Real-time PCRSYBR熒光染料（ SYBR green )TaqMan 探針發(fā)夾型雜交探針輻射生物學(xué)研究方法5TaqManProbeForwar

20、dPrimer53535ReversePrimer535535ForwardPrimerReversePrimerPolymerizationDisplacementQRRQQuantitative Real-time PCR輻射生物學(xué)研究方法Cleavage535355535535Polymerization CompletedRQ33RQQuantitative Real-time PCR輻射生物學(xué)研究方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可作為判斷模板起始濃度的依據(jù)一般以質(zhì)粒梯度稀釋再進(jìn)行PCR得到輻射生物學(xué)研究方法DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移研究與輻射相關(guān)基因最好的方法就是將該基因轉(zhuǎn)入自身無(wú)表達(dá)的細(xì)胞系中，再通過(guò)基因的

21、表達(dá)情況以及細(xì)胞的應(yīng)激調(diào)控來(lái)確定該基因的功能輻射生物學(xué)研究方法微注射：通過(guò)毛細(xì)管直接將外源DNA注射入宿主細(xì)胞核內(nèi)。但難度大，每次只能對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作，效率低磷酸鈣沉淀：磷酸鈣能使DNA沉淀形成大的聚合物，某些細(xì)胞能攝入這種形式的DNA。該方法最為經(jīng)典，但原理尚未知電穿孔：短時(shí)間的電脈沖處理能在懸浮細(xì)胞的膜上形成暫時(shí)打開(kāi)的孔洞，為外源基因的進(jìn)入打開(kāi)了通道。該法適合磷酸鈣沉淀法無(wú)法處理的細(xì)胞病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)是RNA，當(dāng)轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)后，在病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下轉(zhuǎn)成DNA，再摻入宿主的基因組內(nèi)，同宿主基因一起復(fù)制，轉(zhuǎn)錄。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因大小受限制脂質(zhì)體：將DNA包裹在人工制備的

22、磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過(guò)脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移輻射生物學(xué)研究方法DNA文庫(kù)定義：某一特定來(lái)源DNA通過(guò)細(xì)胞DNA克隆技術(shù)構(gòu)建呈含有所用DNA片段的重組DNA分子，并轉(zhuǎn)化至細(xì)菌內(nèi)，構(gòu)成DNA文庫(kù)。依據(jù)DNA的來(lái)源不同，可分為，基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù) ：某種生物的基因組的轉(zhuǎn)錄部分或全部的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的cDNA片段，然后通過(guò)克隆載體，將這些cDNA片段貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體就是這種生物的cDNA文庫(kù) 輻射生物學(xué)研究方法1）提取研究對(duì)象基因組DNA,制備合適大小的DNA片斷，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成c

23、DNA2）DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA3）重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后浸染受體菌4）陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序輻射生物學(xué)研究方法基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建輻射生物學(xué)研究方法插cDNA文庫(kù)的構(gòu)建輻射生物學(xué)研究方法限制性核酸內(nèi)切酶分析Southern雜交體外表達(dá)蛋白DNA序列分析，最準(zhǔn)確和可靠的鑒定方法克隆基因的驗(yàn)證和分析輻射生物學(xué)研究方法DNA測(cè)序雙脫氧DNA鏈合成終止法 （dideoxy-mediated chain-termination method ）原理：反應(yīng)體系中被摻入了2，3-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸

24、末端時(shí), 由于它沒(méi)有3- OH，不能再與其它的脫氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類(lèi)推可以通過(guò)摻入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，則新生鏈的末端為T(mén)、C或G，根據(jù)這個(gè)原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)輻射生物學(xué)研究方法雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖 輻射生物學(xué)研究方法功能基因的失活定點(diǎn)誘變（Site-Directed Mutagenesis）siRNA轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠（Transgenic and Knockout Mice）輻射生物學(xué)研究方法定

25、點(diǎn)誘變可在特定位點(diǎn)精確的引入突變，研究基因的功能兩種誘變方法盒式誘變（Cassette mutagenesis）寡核苷酸引物誘變輻射生物學(xué)研究方法寡核苷酸引物誘變?cè)恚翰恍枰蕾?lài)限制性?xún)?nèi)切酶，直接通過(guò)載體，如噬菌體M13，把含有待突變的目的DNA片斷段克隆到M13中，再以5端磷酸化的待突變堿基的寡核苷酸引物與含有目的基因的M13單鏈DNA退火形成一小段堿基錯(cuò)配的異源DNA，在DNA聚合酶的催化下，引物鏈以M13單鏈DNA為模板合成全長(zhǎng)的互補(bǔ)鏈，然后由連接酶封閉缺口，產(chǎn)生閉環(huán)的異源雙鏈的M13 DNA分子。含異源DNA的M13轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，會(huì)產(chǎn)生野生型和突變型的同源雙鏈DNA分子，再利用斑點(diǎn)法

26、，限制性酶切法等進(jìn)行突變基因的篩選。 84輻射生物學(xué)研究方法寡核苷酸引物誘變輻射生物學(xué)研究方法siRNAsiRNA(Small interfering RNA )：是一種小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer（RNAase 家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素86siRNA作用的原理

27、外源dsRNA入侵，細(xì)胞能通過(guò)RNAi將其清除dsRNA在Dicer酶作用下被裂解成siRNA并在RdRP作用下自擴(kuò)增，再被裂解siRNA雙鏈變單鏈后與蛋白形成復(fù)合物，并與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，使其被RNase裂解輻射生物學(xué)研究方法長(zhǎng)度約在22nt左右。依賴(lài)Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。生成需要Argonaute家族蛋白存在。是RISC組分。siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。siRNA是人工體外合成的，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)上， siRNA是雙鏈RNA。在Dicer酶的加工過(guò)程中， siRNA對(duì)稱(chēng)地來(lái)源于

28、雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。在作用方式上， siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。siRNA不參與生物生長(zhǎng)，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。 siRNA特點(diǎn)輻射生物學(xué)研究方法原理(2025nt雙鏈RNA)輻射生物學(xué)研究方法轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠在器官和集體水平上研究基因的功能將基因轉(zhuǎn)入生殖細(xì)胞系，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠目前常用的轉(zhuǎn)基因方法是微注射法，將外源基因注射入受精卵的核中輻射生物學(xué)研究方法轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠輻射生物學(xué)研究方法 此方法制備的轉(zhuǎn)基因小鼠其基因的插入位點(diǎn)為隨機(jī)插入，另外還受到基因本身及染色體基因組

29、對(duì)外源基因的識(shí)別、修飾因素的干擾等，并不是所有具有外源基因的小鼠都能具有表現(xiàn)型，在傳代過(guò)程中也可能產(chǎn)生基因的丟失，因此，對(duì)于一個(gè)攜帶外源基因的小鼠還需通過(guò)其表型特征或基因的蛋白表達(dá)分析等進(jìn)一步確認(rèn)其是否具有相應(yīng)的表現(xiàn)型；另外通過(guò)交配繁殖確認(rèn)是否具有生殖系遺傳等。一旦確認(rèn)小鼠帶有該外源基因并可傳代，則可進(jìn)一步傳代及純化，篩選并確立一個(gè)穩(wěn)定的新品系輻射生物學(xué)研究方法基因敲除小鼠則是利用同源重組的方式，將一對(duì)同源染色體上相同的等位基因都用失活的基因取代首先要利用同源重組的方式“修飾”一個(gè)等位基因，得到嵌合體小鼠；通過(guò)兩代或多代的選擇育種，選擇出等位基因完全被“修飾”而失活的純合體小鼠。轉(zhuǎn)基因及基因敲

30、除小鼠輻射生物學(xué)研究方法基因的微陣列分析DNA微陣列（DNA microarray）又稱(chēng)DNA陣列或DNA晶片，比較常用的名字是基因晶片（gene chip）。是一塊帶有DNA微陣列（micorarray）的特殊玻璃片或矽晶元片，在數(shù)平方公分之面積上分布了數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)核酸探針；檢驗(yàn)中的DNA、cDNA、RNA等與探針結(jié)合后，通過(guò)熒光或電流的改變來(lái)探測(cè)。一次實(shí)驗(yàn)，即可提供大量基因序列相關(guān)信息目前使用的芯片有兩種類(lèi)型DNA探針的目標(biāo)物被固定在惰性的固體芯片上 寡核苷酸探針在芯片上原位合成此外，還有cDNA和mRNA等芯片，已經(jīng)商業(yè)化輻射生物學(xué)研究方法Westertn Blotting蛋白免疫印跡（

31、Westertn Blotting）：與southern和northern方法類(lèi)似，只是被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)而非DNA或RNA。該方法中使用的“探針”是與待測(cè)蛋白特異結(jié)合的抗體，再通過(guò)帶有第二抗體的底物來(lái)顯色。是目前實(shí)驗(yàn)室中最長(zhǎng)使用的分析蛋白表達(dá)的方法。輻射生物學(xué)研究方法蛋白提取蛋白變性凝膠電泳轉(zhuǎn)膜一抗標(biāo)記二抗標(biāo)記底物顯色Westertn Blotting輻射生物學(xué)研究方法底物的顯色方式HRP 辣根過(guò)氧化酶 ：最常見(jiàn)的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶 ，比活高、特異性更強(qiáng)、分子量?。?0kD）、穩(wěn)定和作用底物范圍廣的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛使用 放射標(biāo)記二抗：目前已較少使用通過(guò)比較底物發(fā)光的有無(wú)來(lái)判斷蛋白是否表達(dá)，但這種方法只能對(duì)蛋白水平做相對(duì)定量Westertn Blotting輻射生物學(xué)研