1、12第五章 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞第一節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞第二節(jié) 重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞3第一節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌41. 目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第一節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞57用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3. 制備原理8二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)（3）轉(zhuǎn)染（transfection)1. 外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)10轉(zhuǎn)化：通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。 轉(zhuǎn)化(transf

2、ormation)11轉(zhuǎn)導(dǎo)：當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來，再次感染另一受體細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)12例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。轉(zhuǎn)化（transformation)14噬菌體的生活史例轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)1510ng載體DNA100L感受態(tài)菌On ice混合，靜置10分鐘42C 1分鐘加入1mL LB培養(yǎng)基37搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法17LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2C離心集菌冰冷的水重懸菌體2C離心集

3、菌冰冷的水重懸菌體2C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOn ice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法184. 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37過夜19環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒 5. 影響轉(zhuǎn)化率的因素20目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連21生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長期的菌。必須在冰冷的條件下

4、制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜增加通透性。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70以下CaCl2處理使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞 （competent cells) 22cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到4445時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。（2）cI857基因突變的噬菌體 24噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（3） 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因D

5、發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體225(4) 體外包裝過程 27體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。（5） 轉(zhuǎn)導(dǎo) 2829第二節(jié) 外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞二、導(dǎo)入植物細(xì)胞三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞30轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第二節(jié) 外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1. 菌株選擇如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his3131（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2. 酵

6、母的轉(zhuǎn)化方法 酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化32 酵母0.1mol/L LiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài) 40% PEG（聚乙二醇）（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化33葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1. 葉盤法（leaf disk)34植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2. 電擊法（electroporation)35又稱高速微型子彈射擊法（High-vel

7、ocity microprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（gene gun）36基因槍37（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1. 磷酸鈣沉淀法HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。38不需要載體。（2）特點(diǎn)：39脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如Life Technologies）。2. 脂質(zhì)體（lipofectin）載體法脂類包埋DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。40直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3. 顯微注射法(microinjection)41二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入外源DNA。4. DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡