1、Molecular Biology Course第九章 原核生物基因表達調控教學要求掌握操縱子的結構理解誘導和阻抑操縱子的調控機制理解葡萄糖對乳糖操縱子的調控方式掌握色氨酸對操縱子的阻抑和弱化作用第1節(jié) 基因表達調控的基本概念第2節(jié) The Lac operon 乳糖操縱子第3節(jié) The trp operon 色氨酸操縱子第4節(jié) 不同因子對轉錄的調節(jié)主要內容第1節(jié) 基因表達調控的基本概念一、基因表達的概念gene expression ：基因轉錄及翻譯的過程。對這個過程的調節(jié)就稱為gene regulation 。rRNA、tRNA編碼基因轉錄合成RNA的過程也屬于基因表達 組成性表達(con

2、stitutive expression) 適應性表達(adaptive expression）二、基因表達的方式 2、適應性表達指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。應環(huán)境條件變化基因表達水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(induction)，這類基因被稱為可誘導的基因(inducible gene)；相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應的基因被稱為可阻遏的基因(repressible gene)。 三、基因表達的規(guī)律 時間性和空間性1、時間特異性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，

3、稱之為基因表達的時間特異性。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stage specificity)。 2、空間特異性(spatial specificity)基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。在個體生長全過程，某種基因產物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性。四、基因表達調控的生物學意義適應環(huán)境、維持生長和增殖（原核、真核）維持個體發(fā)育與分化（真核）五、 基因表達調控的基本原理(一) 基因表達的多級調控基因表達調控可見于從基因激

4、活到蛋白質生物合成的各個階段，因此基因表達的調控可分為轉錄水平（基因激活及轉錄起始）轉錄后水平（加工及轉運）翻譯水平翻譯后水平但以轉錄水平的基因表達調控最重要。 (1) 原核生物的順式作用元件 原核生物基因表達與調控是通過操縱子機制來實現(xiàn)的。其順式作用元件由啟動基因、操縱基因組成。(2) 真核生物的順式作用元件 在真核生物中，與基因表達調控有關的順式作用元件主要有啟動子（promoter）、增強子（enhancer）和沉默子（silencer） 1.順式作用元件：又稱分子內作用元件，指存在于DNA分子上的一些與基因轉錄調控有關的特殊順序。操縱子The operon model 操縱子模型 Ja

5、cob and Monod , 1961 獲1965年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎 操縱子：是基因表達的協(xié)調單位，由調節(jié)基因、啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組成。Control elementStructural genes 操縱子調節(jié)基因 啟動序列 操縱序列 編碼序列（結構基因） 表達 轉錄ICAPPOZYA阻遏蛋白結合部位RNA聚合酶結合部位多順反子mRNA 功能上相關聯(lián)的多個結構基因受同一啟動序列調控，被一起轉錄和翻譯生成多種蛋白質的 mRNA 。啟動序列（P）： 其中的-35區(qū) -10區(qū)是RNA聚合酶識別并結合的部位。 多順反子mRNA阻遏蛋白（負性調節(jié)） （ 正性調節(jié)

6、）多種蛋白質 R P O ST1 ST2T 啟動 操縱 調節(jié)基因 基因 基因 結構基因控制區(qū) 操縱元信息區(qū)操縱元模型的一般結構2反式作用因子（trans-acting factor） 定義：又稱為分子間作用因子，指一些與基因表達調控有關的蛋白質因子。 反式作用因子與順式作用元件之間的共同作用，才能夠達到對特定基因進行調控的目的。1) 原核生物的反式作用因子（3類）特異因子 決定RNA聚合酶對啟動序列的特異識別和結合能力； (如RNA聚合酶的 因子)阻遏蛋白 通過與操縱序列結合，阻遏基因轉錄，發(fā)揮負性調控作用； （由調節(jié)基因表達的阻遏蛋白）激活蛋白 與啟動子上游DNA序列結合，促進RNA聚合酶轉

7、錄活性，發(fā) 揮正性調控作用。（如，CAP分解代謝物基因活化蛋白） 2)真核生物的反式作用因子 真核生物中的反式作用因子通常稱為轉錄因子 按其功能不同，常有以下三類： 基本轉錄因子 轉錄調節(jié)因子 共調節(jié)因子 第2節(jié) The Lac operon 乳糖操縱子一、乳糖操縱子的結構二、乳糖操縱子的調節(jié)機制一、乳糖操縱子的結構大腸肝菌能夠利用乳糖：環(huán)境中乳糖作為唯一碳源 表達并合成一系列與乳糖代謝相關的酶類環(huán)境中沒有乳糖 編碼上述乳糖代謝酶的基因則被關閉一、乳糖操縱元的結構 i基因 P O lacZ lacY lacA阻遏 基因 CAP 啟動子 操縱基因 結構基因 代謝激活蛋白結合位點一、乳糖操縱子的結

8、構(一) 乳糖操縱子的結構a regulatory gene (調節(jié)基因): Lac I, encode the lac repressor (編碼乳糖阻抑物)3 stuctural genes (結構基因): Lac Y、 Lac Z、 Lac A 2 control elements (調控元件): Plac（啟動子)、 Olac(操縱基因位點)lacIRegulatory genelacZlacYlacADNAm-RNA -GalactosidasePermeaseTransacetylaseProteinStructural GenesPlacIPlacOlaclacY編碼半乳糖苷滲透

9、酶)，促進半乳糖苷進入細胞lacZ編碼半乳糖苷酶，將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖lacA 編碼硫代半乳糖苷轉乙酰酶G2: The LAC operonlacZ, lacY, lacA 三個結構基因位于同一個轉錄單元中。1.結構基因G2: The LAC operon2. 操縱基因位于 -5至21這段區(qū)域，和啟動子的右側末端重疊，2628bp是阻遏蛋白的結合位點。(回文對稱): 當一條鏈以5到3方向從左向右讀與其互補鏈5到3方向從右向左讀時具有相同的序列。以+11為對稱軸，每邊為兩段各6bp反向重復序列 3. 乳糖阻抑物Regulation of Transcription in Prokaryot

10、es(1) 是由4個相同亞基組成的同源四聚體(2) 具有兩個結合位點：操縱基因結合位點和誘導物結合位點(3) 無誘導物存在時，能阻止基因的轉錄,誘導物通過與阻遏物結合，改變它的構象，使之不能與操縱區(qū)相結合，激活基因轉錄。(4) 阻遏蛋白和DNA的結合能增強RNA聚合酶結合DNA的能力乳糖操縱元的雙調控系統(tǒng)： (1)受乳糖與阻遏蛋白調控的、可誘導的負調控系統(tǒng); (2)受cAMP與CAP調節(jié)的、可誘導的正調控系統(tǒng)。葡萄糖通過調節(jié)cAMP的合成間接監(jiān)控這一過程。 以此保證大腸桿菌靈活、經濟、有效地適應外界環(huán)境，只有在必需的時候（只有乳糖，沒有葡萄糖）才啟動乳糖操縱子的表達。二、乳糖操縱子的調節(jié)機制二

11、、乳糖操縱子的調節(jié)機制(一) 負調節(jié)機制1. 無誘導物時，阻抑物與操縱基因結合，阻止轉錄 2. Induction 誘導誘導物跟乳糖阻抑物結合，改變了阻抑物的構象，使其不能結合到操縱位點上。G2: The LAC operon 誘導物和結合于操縱基因上的阻遏物結合，使其從操縱基因上釋放。而不是和游離阻遏物結合，影響阻遏物和DNA結合的平衡 誘導物改變阻遏蛋白在DNA上的分布，而不是產生游離阻遏蛋白：隨機DNA序列和阻遏蛋白也具有親和力，但比操縱基因和阻遏蛋白的親和力低107倍誘導物和阻遏蛋白結合時，阻遏蛋白和操縱基因的親和力下降，所有阻遏蛋白結合在DNA的隨機序列上除去誘導物后，阻遏蛋白恢復活

12、性，從隨機位點直接轉移到操縱基因上ipozyaVery low level of lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozyab-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresence of lactoseInactiveLactose(乳糖) is present, the low basal level of permease(透過酶) allows its uptake, and-galactosidase (半乳糖苷酶)catalyzes the conversion of some lactose to allolact

13、ose (異乳糖).Allolactose acts as an inducer, binding to the lac repressor and inactivate it. Lactose (allolactose) ：天然的誘導物IPTG(異丙基-b-D-硫代半乳糖苷), 人工合成的誘導物，, 能快速激活乳糖操縱子結構基因的轉錄，但自身不被分解(義務誘導物)IPTG is used to induce the expression of the cloned gene from LacZ promoter in many vectors, such as pUC19.AmproripU

14、C18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多克隆位點）Lac promoterlacZGene XNo IPTG, little expression of X geneWith IPTG, efficient expression of X gene.L1: The LAC operon可誘導調控的操縱元，其基因表達產物都是利用某種營養(yǎng)物的酶體系（分解代謝） 有營養(yǎng)物 相應基因開放 無營養(yǎng)物 細胞就沒必要產生相應的酶 2CAP位點 操縱序列RNA聚合酶 啟動序列cAMPmRNA 5 DNA結合區(qū)與CAP位點結合CAP(同二聚體),含 cAMP結合區(qū) cAMP-

15、CAP復合物（有活性）CAP（二） CAP的正性調節(jié)作用 1. CRP，cAMP受體蛋白G2: The LAC operonCRP 是一種轉錄激活因子(分解代謝激活蛋白,CAP)與cAMP結合后才有活性：CAP與cAMP結合后，發(fā)生空間構象的變化而活化，能以二聚體的方式與特定的DNA序列結合，從而增強RNA聚合酶的轉錄活性，可使轉錄提高50倍cAMP 水平受 葡萄糖調節(jié) CRP 激活因子參與分解代謝操縱子對葡萄糖水平反應的基因表達的全局調控。 cAMP：Cyclic AMPATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉變成環(huán)腺苷酸 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP)。

16、 When glucose is present當葡萄糖存在時，細胞中cAMP含量低，CRP以二聚體的形式存在，從而不能跟DNA結合調控轉錄。 When glucose is absent 當葡萄糖缺乏時，cAMP含量升高，與CRP結合；CRP-cAMP復合物結合到啟動子中RNA聚合酶結合位點上游的序列，使DNA彎曲90 ，增強了RNA聚合酶跟啟動子的結合，使轉錄提高了50倍。 CRP-binding site is an inverted repeat.正調節(jié)當阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用如無CAP存在，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合，操縱子仍無轉錄活性。 cAMPCAP復

17、合物與啟動子區(qū)的結合是轉錄起始所必需的。(三) 協(xié)調調節(jié)葡萄糖對 lac 操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏(catabolic repression)。 單純乳糖存在時，細菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時，細菌首先利用葡萄糖。The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCome on, let m

18、e throughNo wayJose!CAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee!The Lac O

19、peron:When Glucose and Lactose are PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.Come on, let me throughCAPRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorRepressorThis lactose has bent me out of shapeLacXThe Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromo

20、terLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!第2節(jié) The Trp Operon 色氨酸操縱子一、色氨酸操縱子的結構二、色氨酸操縱子的調節(jié)機制三、正調控系統(tǒng)和負調控系統(tǒng)Regulation of Tran

21、scription in Prokaryotes調控基因 結構基因 催化分枝酸轉變?yōu)樯彼?的酶一、色氨酸操縱元的結構trpR trpRPLeader前導序列編碼色氨酸合成所需的5種結構基因當細胞中色氨酸短缺時，這些基因協(xié)同表1. 特點: (1) trpR和trpABCDE不連鎖； (2) 操縱基因在啟動子內 (3) 有衰減子(attenuator)/弱化子 (4) 啟動子和結構基因不直接相連，二者被 前導序列(Leader)所隔開 ABCG3: The trp operonG3: The trp operon二、色氨酸操縱子的調節(jié)機制(一) 負調控機制(二) 弱化系統(tǒng)Regulation o

22、f Transcription in Prokaryotes調節(jié)基因 trpR編碼色氨酸阻抑物與色氨酸形成復合物后，與操縱基因相結合，阻止結構基因的轉錄Trp ：協(xié)同抑制因子 ，能抑制色氨酸的合成(負反饋調控)能使轉錄的起始效率下降70倍是一種 粗調控機制，調節(jié)轉錄的起始(一) 負調控機制G3: The trp operon The repressor is a dimer (二聚體) of two subunits which has a structure with a central core (中心區(qū)域) and two flexible DNA-reading heads (DNA解

23、讀頭部) (carboxyl-terminal of each subunit )central coreDNA-reading heads色氨酸阻抑物G3: The trp operontrpR operontrp operonO 阻遏蛋白 mRNATrp trpRPtrpEtrpDtrpCtrpBtrpA轉錄生成162核苷酸長的前導序列， 可以形成“衰減子”結構（結構基因關閉）調節(jié)區(qū) 在高濃度色氨酸存在下，通過形成特殊的“衰減子”結構，對轉錄進行更精細的調控。 (二) 弱化系統(tǒng)有活性1. 前導RNA的結構 Regulation of Transcription in Prokaryotes

24、在trp mRNA5端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。含有四個互補序列區(qū)，堿基互補形成不同的結構Complementary 3:4 termination of transcription Complementary 2:3 Elongation of transcription free leader RNAG3: The trp operon2. 前導肽Regulation of Transcription in Prokaryotes前導RNA含有一個有效的核糖體結合位點，并能編碼一個由14個氨基酸組成的前導肽 該前導序列的第10個和11個密碼子編碼色氨酸。單林娜

25、 制作71 3. 弱化子： DNA中可導致轉錄過早終止的一段核苷酸序列（123-150區(qū)）。123150Attenuator sequencecharacteristic位于前導序列(在trpE起始密碼子之前)的末端非依賴型的終止位點，有一富含GC的回文對稱結構，緊跟著一串8個U殘基序列高效的轉錄終止子3. 弱化作用Regulation of Transcription in Prokaryotes Transcription and translation in bacteria are coupled. Therefore, synthesis of the leader peptide

26、immediately follows the transcription of leader RNA, and the attenuation is possible.High trp (attunation) Lack of trp (proceeding through the whole operon ) Transcription of the trp operon During transcription of the RNA from trp operon, the RNA Polymerease pauses at the end of sequence 2 (sequence

27、s 1 and 2 form a hairpin) until a ribosome began to translate the leader peptide.G3: The trp operon單林娜 制作76 Low tryptophan levels當色氨酸濃度低時，生成的tRNAtrp就少，核糖體在序列1的trp密碼子處暫停，序列2和3之間形成配對結構，阻止了衰減，因為序列3不再與序列4之間形成衰減結構，RNA聚合酶得以沿DNA前進，繼續(xù)去轉錄其后trpE等基因，trp操縱元就處于開放狀態(tài)。 單林娜 制作77 當色氨酸濃度增高時，tRNAtrp濃度隨之升高，核糖體快速翻譯序列1(前導

28、肽閱讀框)，占據(jù)到2的機會增加，1和2生成發(fā)夾結構的機會減少，3和4形成類似終止子的衰減子結構的機會增多，導致RNA聚合酶終止轉錄。High tryptophan levels通過前導肽中核糖體所處的位置，實現(xiàn)RNA聚合酶對DNA轉錄的影響。 Low TrpHigh TrpImportance of attenuation 衰減作用的重要性 細菌通過弱化作用彌補阻遏作用的不足，因為阻遏作用只能使轉錄不起始，對于已經起始的轉錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細胞內色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細胞內載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導肽的翻譯來控制轉錄的進行，在細菌細胞內這

29、兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內周密的調控作用。Regulation of Transcription in Prokaryotes如果其他氨基酸不足，對轉錄有何影響？三、正調控系統(tǒng)和負調控系統(tǒng)1)根據(jù)操縱子對調節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的應答，可分為： 正轉錄調控 負轉錄調控調節(jié)基因操縱基因結構基因阻遏蛋白激活蛋白正轉錄調控負轉錄調控正轉錄調控如果在沒有調節(jié)蛋白質存在時基因是關閉的，加入這種調節(jié)蛋白質后基因活性就被開啟，這樣的調控正轉錄調控。調節(jié)基因操縱基因結構基因阻遏蛋白激活蛋白正轉錄調控負轉錄調控負轉錄調控在沒有調節(jié)蛋白質存在時基因是表達的，加入這種調節(jié)蛋白質后基因表達活性便被關閉，

30、這樣的調控負轉錄調控。可誘導調節(jié)：指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質的誘導下使基因活化。 例：大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因根據(jù)操縱子對某些能調節(jié)它們的小分子的應答，可分為可誘導調節(jié)和可阻遏調節(jié)兩大類：調節(jié)基因操縱基因結構基因阻遏蛋白調節(jié)基因操縱基因結構基因阻遏蛋白誘導物mRNA酶蛋白酶合成的誘導操縱子模型誘導物如果某種物質能夠促使細菌產生酶來分解它，這種物質就是誘導物?？勺瓒粽{節(jié)：基因平時是開啟的，處在產生蛋白質或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達。 例：色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因酶

31、合成的阻遏操縱子模型調節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白調節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物輔阻遏物如果某種物質能夠阻止細菌產生合成這種物質的酶，這種物質就是輔阻遏物。3) 在負轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結構基因轉錄的作用。 根據(jù)其作用特征又可分為負控誘導和負控阻遏：在負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物（誘導物）結合時，結構基因轉錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物（輔阻遏物）結合時，結構基因不轉錄。4) 在正轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是激活蛋白（activator）。 根據(jù)激活蛋白的作用性質分為正控誘導和正控阻遏在正控誘導系統(tǒng)中，效應物分子（誘

32、導物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應物分子（輔阻遏物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。InductionInducerInducerPositive controlNegative control負控誘導系統(tǒng)正控誘導系統(tǒng)Negative controlPositive controlRepressionCorepressorCorepressor負控阻遏系統(tǒng)正控阻遏系統(tǒng)Regulation of Transcription in Prokaryotes第4節(jié) 不同因子對轉錄的調節(jié)Sigma factor Heat shock 熱休克Sporulation in B. su

33、btilis 枯草芽孢桿菌的孢子形成Bacteriophage factors 噬菌體因子 factor subunit bound to RNA pol for transcription initiation Released core enzyme RNA elongation 1. factors is bifunctional(雙功能蛋白) protein Bind to core RNA Pol 跟核心RNA聚合酶結合Recognize specific promoter sequence (-35 and 10) in DNA 識別DNA中特異的啟動子序列Transcriptio

34、nal regulation by alternative Factorss factor:Transcriptional regulation by alternative Factors許多細菌能產生一系列不同的因子，用以滿足在正常和極端生長條件下調控轉錄的需要。E. coli: Heat shock 熱休克Sporulation in bacillus subtilis 枯草芽孢桿菌的形成Bacteriophage(噬菌體)factorsTranscriptional regulation by alternative Factors大腸桿菌中的各種因子比較因子編碼基因主要功能70rpoD參與對數(shù)生長期和大多數(shù)碳代謝過程基因的調控54rpoN參與多數(shù)氮源利用基因的調控38rpoH分裂間期特