ICS?FORMTEXT13.060FORMTEXTZ16FORMTEXT?????DBFORMTEXT37DBFORMTEXT37/T3632—2019FORMTEXT?????FORMTEXT漁業(yè)用水中多西環(huán)素、四環(huán)素、土霉素、金霉素殘留量的測定高效液相色譜法FORMTEXTDeterminationofdoxycycline,tetracycline,oxytetracycline,chlortetracycline，residuesinfisherywaterbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC)2019-07-23發(fā)布2019-08-23實(shí)施FORMTEXT山東省市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DB37/T3632—2019前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13原理 14試劑與配制 15儀器和設(shè)備 26試樣的測定 26.1樣品的制備 26.2樣品的提取凈化 26.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 26.4測定 27計(jì)算 38檢測限 39回收率 310精密度 4附錄A（資料性附錄）色譜圖 5前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋與漁業(yè)廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(魯TC03)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷偉、孟麗華、時(shí)彥民、劉方、吳廣州、蔣幫銅、孟娟、鄧晨曦、簡康、時(shí)兵。漁業(yè)用水中多西環(huán)素、四環(huán)素、土霉素、金霉素殘留量的測定

高效液相色譜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了漁業(yè)用水中土霉素(Oxytetracycline)、四環(huán)素（Tetracycline）、金霉素(Chlortetracycline)、多西環(huán)素（Doxycycline，Vibramycin又名強(qiáng)力霉素、脫氧土霉素）殘留量的測定原理、試劑與配制、儀器和設(shè)備、試樣的測定、計(jì)算、檢測限、回收率與精密度等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于漁業(yè)用水中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理水樣經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀配紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。試劑與配制所用試劑除另有規(guī)定外，均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。磷酸：色譜純。磷酸二氫鈉。0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉1.56g，用950mL水溶解，磷酸調(diào)pH至2.5，用水稀釋并定容至1000mL，過0.45μm水相濾膜備用。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品：（CAS：2058-46-0）純度≥96.0%。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：（CAS：64-75-5）純度≥94.0%。金霉素標(biāo)準(zhǔn)品：（CAS：64-72-2）純度≥99.0%。多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：（CAS：24390-14-5）純度≥98.0%。土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，金霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.0200g，用甲醇溶解并定容至100mL，制得土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素濃度分別為100μg/mL，金霉素濃度為200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存，有效期6個(gè)月。土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別移取4.10中的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.0mL，定容至100mL，制得土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素濃度為10μg/mL，金霉素濃度為20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，0℃～4℃避光保存，有效期2周。儀器和設(shè)備液相色譜儀，配紫外檢測器。氮吹儀。超聲波清洗器。超純水儀。渦旋混合器。分析天平：感量0.0001g。HLB固相萃取柱：60mg，3mL，或性能相當(dāng)者。抽濾裝置。試樣的測定樣品的制備水樣經(jīng)0.45μm濾膜過濾，備用。樣品的提取凈化固相萃取小柱預(yù)先用3mL甲醇、3mL水活化，準(zhǔn)確量取60mL經(jīng)過濾后的水樣（6.1），轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，控制流速不超過2mL/min，用5mL水淋洗小柱，抽干，用8mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10mL具塞玻璃離心管中，于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘留物?.0mL流動(dòng)相溶解定容，渦旋混合1min，超聲2min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別準(zhǔn)確移取0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（4.11），用流動(dòng)相定容至100mL，制得一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其中土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素濃度系列為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0μg/mL；金霉素標(biāo)準(zhǔn)使用濃度系列為0.10、0.20、0.50、1.0、2.0μg/mL。此標(biāo)準(zhǔn)使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。以峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測定色譜參考條件色譜柱：XDB-C18柱，250mm×4.6mm（i.d.），5μm；或者性能相當(dāng)者。流動(dòng)相：A：乙腈；B：0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液（4.5）。流速：1.0mL/min。進(jìn)樣量：50μL。波長：350nm。柱溫：30℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間（min）A（%）B（%）017.083.01532.068.01645.055.01745.055.01817.083.02517.083.0液相色譜測定在上述色譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液分別進(jìn)行測定，土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素保留時(shí)間分別為6.2min、7.5min、12.1min、13.5min。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。液相色譜圖參見附錄A（圖A.1、圖A.2）?？瞻自囼?yàn)除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進(jìn)行。液相色譜圖參見附錄A（圖A.3）。計(jì)算試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量按公式計(jì)算。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。 (SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1)式中：X——樣品中各抗生素含量，單位為毫克每升（mg/L）；C——樣品溶液中各抗生素含量，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；V0——樣品溶液量取體積，單位為毫升（mL）。檢測限本方法土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素檢出限為5μg/L、定量限為10μg/L；金霉素檢出限為10μg/L、定量限為20μg/L?；厥章释撩顾?、四環(huán)素、多西環(huán)素在添加濃度10μg/L～50μg/L時(shí)，回收率均為70%～110%；金霉素在添加濃度20μg/L～100μg/L時(shí)，回收率均為70%～110%。精密度本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。

（資料性附錄）

色譜圖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖A.1，水樣加標(biāo)樣品色譜圖見圖A.2，空白水樣色譜圖見圖A.3。說明：土霉素——濃度為