第十二章基因工程的基本條件第三節(jié)、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞第二節(jié)、用于基因克隆的載體第一節(jié)、用于核酸操作的工具酶第一節(jié)、用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶一、限制性核酸內(nèi)切酶1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

一、限制性核酸內(nèi)切酶4.II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’一、限制性核酸內(nèi)切酶5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作（1）大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量一、限制性核酸內(nèi)切酶5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作（2）II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’一、限制性核酸內(nèi)切酶5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作（2）II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.22.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥一、限制性核酸內(nèi)切酶6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（1）DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間一、限制性核酸內(nèi)切酶6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素⑵

DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基一、限制性核酸內(nèi)切酶6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象

EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’二、DNA連接酶1.DNA連接酶的基本性質(zhì)（1）修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick二、DNA連接酶1.DNA連接酶的基本性質(zhì)（2）修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’二、DNA連接酶1.DNA連接酶的基本性質(zhì)（3）連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶二、DNA連接酶2.DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量二、DNA連接酶3.平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性(1)大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdN

Mg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口平移標(biāo)記法(2)大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP

5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation制備32P標(biāo)記的探針DNaseIDNApolI三、DNA聚合酶2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）(1)Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性三、DNA聚合酶2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）(2)Klenow酶的基本用途：a.補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’(2)Klenow酶的基本用途：

b.DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’c.cDNA第二鏈的合成d.雙脫氧末端終止法測定DNA序列三、DNA聚合酶3.T4-DNA聚合酶（1）T4-DNA酶的基本特性：在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性三、DNA聚合酶3.T4-DNA聚合酶（2）T4-DNA聚合酶的用途：a.切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多三、DNA聚合酶3.T4-DNA聚合酶（2）T4-DNA聚合酶的基本用途：

b.DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘三、DNA聚合酶4.依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）（1）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：a.以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA三、DNA聚合酶4.依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）（1）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：b.雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’四、核酸酶1.單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’四、核酸酶2.雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切四、核酸酶3.雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’四、核酸酶4.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（1）S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍四、核酸酶4.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（2）S1核酸酶的基本反應(yīng)：a.內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs四、核酸酶4.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（2）S1核酸酶的基本反應(yīng)：b.內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘四、核酸酶4.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（3）S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI四、核酸酶5.單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+四、核酸酶5.單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIEcoRIEcoRIBal31環(huán)化ABCBCABCAAC五、核酸修飾酶1.末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：來自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPsAAAAAAAAAAAA

OH3‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOp5‘TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAA五、核酸修飾酶2.堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON五、核酸修飾酶3.T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末端同位素標(biāo)記：第二節(jié)、用于基因克隆的載體第二章基因工程的基本條件二、質(zhì)粒（plasmid）三、噬菌體或病毒DNA四、考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒五、人造染色體載體一、載體的功能及特征一、載體的功能及特征（一）載體的功能1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件一、載體的功能及特征（二）載體應(yīng)具備的條件1.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

5.具有合適的篩選標(biāo)記3.具有較高的外源DNA的載裝能力4.具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征◆質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子◆質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中◆絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA◆質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征1.質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征1.質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征1.質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征2.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征2.質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征3.質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由

bom和mob

基因決定二、質(zhì)粒（一）質(zhì)粒的基本特征4.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義二、質(zhì)粒（二）質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE1

6.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr二、質(zhì)粒（三）質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選二、質(zhì)粒（四）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr二、質(zhì)粒（四）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’二、質(zhì)粒（四）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal二、質(zhì)粒（四）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個噬菌體的強(qiáng)啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等二、質(zhì)粒（五）質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間二、質(zhì)粒（五）質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAscccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA二、質(zhì)粒（五）質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

二、質(zhì)粒（五）質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA三、噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA1.l噬菌體的生物學(xué)特性：a生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因1.l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA1.l噬菌體生物學(xué)特性：b

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA1.l噬菌體生物學(xué)特性：b

感染周期體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA1.l噬菌體生物學(xué)特性：c

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：a縮短長度

野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：b刪除重復(fù)的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：c加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記三、噬菌體或病毒DNA（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：c加裝選擇標(biāo)記

imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑三、噬菌體或病毒DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：c加裝選擇標(biāo)記

lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA2.l-DNA載體的構(gòu)建：d構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA3.l-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑。（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA4.l-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA5.l-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA6.l-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA三、噬菌體或病毒DNA（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA1.M13噬菌體的生物學(xué)特性：

a生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長

三、噬菌體或病毒DNA1.M13噬菌體的生物學(xué)特性：b感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA三、噬菌體或病毒DNA（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA2.M13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker三、噬菌體或病毒DNA（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA3.M13DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb三、噬菌體或病毒DNA與動植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動植物的病

毒基因組DNA。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。（三）病毒DNA四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

科斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建科斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于科斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒1.科斯質(zhì)粒（cosmid）（1）科斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：科斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒1.科斯質(zhì)粒（cosmid）（2）科斯質(zhì)粒載體的特點：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒2.噬菌粒（phagemidorphasmid）（1）噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒2.噬菌粒（phagemidorphasmid）(2)重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA四、科斯質(zhì)粒與噬菌粒2.噬菌粒（phagemidorphasmid）（3）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄五、人造染色體載體

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染