關(guān)于植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)第1頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第一節(jié)實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù)第二節(jié)培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌第三節(jié)植物離體培養(yǎng)體系的建立

本章內(nèi)容第2頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計要求：準備室;無菌操作室;培養(yǎng)室;溫室；細胞學實驗室第一節(jié)實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù)第3頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（一）準備室：

1.主要功能：用于培養(yǎng)器皿的清洗、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。2.主要儀器設(shè)備及用品：

冰箱、天平、高壓滅菌鍋、pH計、干燥箱、實驗臺、水槽、涼干架、藥品柜、離心機、水浴鍋、微波爐、電爐、磁力攪拌器、蠕動泵、移液器、各種玻璃器皿（燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、三角瓶等）及培養(yǎng)基分裝用品等。第4頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五百分之一天平千分之一天平萬分之一天平第5頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五各種型號的高壓滅菌鍋第6頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

移液器第7頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）接種室（無菌操作室）：

1、功能：植物材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等。接種室要求保持潔凈，與化學實驗室之間應(yīng)設(shè)置緩沖室。2、儀器設(shè)備及用品：

超凈工作臺、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具（各種鑷子、解剖刀、手術(shù)剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細菌過濾器等）等。第8頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五超凈工作臺第9頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（三）培養(yǎng)室：

1、功能：主要用于植物材料的培養(yǎng)。要求室內(nèi)潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕度以適合植物材料的生長和分化。2、儀器設(shè)備及用品：培養(yǎng)架及燈管、搖床（振蕩器）、空調(diào)、自動定時器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱、溫濕度計等。第10頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五培養(yǎng)架第11頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五光照培養(yǎng)箱第12頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五恒溫振蕩器

多用振蕩器第13頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（四）細胞學實驗室：

1、功能：主要用于培養(yǎng)材料的顯微觀察及照相等。2、儀式設(shè)備及用品：

體視顯微鏡、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機或數(shù)碼相機、切片機及配套制片及染色用品等。第14頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五體視顯微鏡普通光學顯微鏡倒置顯微鏡倒置熒光顯微鏡第15頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五二、實驗室基本操作：（一）洗滌：

1、普通器皿：采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌。

2、難清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡，最后清水沖洗，或用超聲波儀清洗。第16頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）滅菌：

1、器具滅菌：培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。（1）干熱滅菌：鋁箔包好后，放于恒溫干燥箱內(nèi)，150℃保溫2小時，成本較高。（2）高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120℃15-20min

。（3）灼燒滅菌：接種時，解剖刀及鑷子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。第17頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、培養(yǎng)基滅菌：

采用高壓蒸汽滅菌，120℃15－20min。培養(yǎng)基體積越大，滅菌時間越長。3、不耐高溫化合物：

采用過濾滅菌，如IAA等。4、外植體的表面滅菌：

采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸鈉（5-30分鐘）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分鐘）等。殺菌劑中加入幾滴吐溫－20或80（Tween－20或80）效果較好。第18頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（三）無菌操作：

1、保持接種室的無污染環(huán)境，定期熏蒸或噴霧處理，進行消毒。接種前打開超凈工作臺及紫外燈照射20-30min，關(guān)閉紫外等燈后使氣體散出后開始操作。

2、保持超凈工作臺的潔凈：接種前用70％乙醇擦拭臺面或用噴壺噴霧，操作前，將手和手臂用70％乙醇消毒，所需試驗用品用乙醇擦拭后放入超凈工作臺。第19頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3、點燃酒精燈，進行操作，接種材料前后，灼燒瓶口，工具要灼燒徹底，防止交叉污染。4、保持接種室的潔凈，發(fā)現(xiàn)污染及時挑出，并在滅菌后清洗，以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。第20頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

第二節(jié)培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌第21頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、培養(yǎng)基的組成和作用培養(yǎng)基（medium）是植物組織培養(yǎng)的重要材料，是外植體生長的營養(yǎng)物質(zhì)，只有配制出適宜的培養(yǎng)基，才能使組織培養(yǎng)獲得成功。通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標是營養(yǎng)成分及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度。第22頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

培養(yǎng)基成分

水

植物激素

碳源

有機物（維生素、肌醇、氨基酸）

培養(yǎng)體支持材料

輔助性物質(zhì)

無機鹽（大量元素、微量元素、鐵鹽）第23頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

碳源碳源主要為細胞提供合成新化合物的骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在10-50g/L，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。但在胚培養(yǎng)時采用40-150g/L的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用糖濃度高低直接影響形態(tài)建成。第24頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五無機鹽元素名稱添加形式

NKNO3,NH4NO3大量PKH2PO4NaH2PO4元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA微量BH3BO3元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O第25頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五種類：VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、Vpp（煙酸）、Vc(抗壞血酸）濃度：0.1-1.0mg/L

作用：VB1促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力

VB6促根生長

Vpp與代謝和胚發(fā)育有關(guān)

Vc防組織褐變維生素第26頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五肌醇(又叫環(huán)己六醇）

能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。使用濃度一般為50～lOOmg／L第27頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五氨基酸(alminoacide)

培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用，用量在1-3mg／L之間。有時應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在10～1000mg／L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。第28頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五1、生長素類(auxin)（1）IAA(吲哚乙酸)是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。（2）NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3～4倍，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。（3）IBA(吲哚丁酸)是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。（4）2,4-D(2,4-2氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。植物激素第29頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、細胞分裂素類(cytokinin)（1）6-BA(6-芐基氨基嘌呤）應(yīng)用廣，人工合成。（2）Zt(zeatin玉米素)是一種活性最大的天然細胞分裂素，效果顯著，但非常昂貴。（3）Kt(糠基腺嘌呤）功能：①誘導(dǎo)芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長。②促進細胞分裂與擴大。③抑制根的分化第30頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

3、GA(gibberellicacid赤霉素)

培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當生長素/赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。第31頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

高有利于根的形成和愈傷組織

生長素/細胞分裂素

適中有利于根芽的分化

低有利于芽的形成

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。一般生長素濃度的使用為0.05～5mg／L，細胞分裂素0.05～10mg／L。第32頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂A用量7－10g/LB新買應(yīng)試凝固力2.其它玻璃纖維濾紙橋海綿等▲第33頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五輔助性物質(zhì)抗生素抗氧化物活性炭天然復(fù)合物▲第34頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五1.常用種類：青霉素鏈霉素慶大霉素等2.用量：5－20%3.注意：抗生素對組織生長有抑制作用，使用要慎重

抗生素第35頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五抗氧化物常用抗氧化劑及使用：半胱氨酸、VC（50－200mg/L液洗滌外植體傷口表面）。

活性炭1.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進新梢增殖（濃度0.1-0.2%）；促進生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.5-10g/L

3.注意：活性炭具副作用。▲第36頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五椰乳：一般使用濃度在100～200ml／L它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用。香蕉：用量為100～200ml／L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進作用。馬鈴薯(potato)：去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150～200g／L，對pH值緩沖作用也大，添加后可得到健壯的植株。水解酪蛋白：為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100～200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用時要注意。天然復(fù)合物第37頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

培養(yǎng)基種類MS培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基White培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基的類型：第38頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五N6培養(yǎng)基特點：成分簡單KNO3

和(NH4)2SO4含量高適合花藥培養(yǎng)★White培養(yǎng)基特點：無機鹽量較低，適合生根培養(yǎng)第39頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五B5培養(yǎng)基特點：含較低的銨雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇MS培養(yǎng)基特點：無機鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。有機成分復(fù)雜用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))KM-8P培養(yǎng)基特點：第40頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五表1

MS培養(yǎng)基的組成配方組成成分數(shù)量(mg/L)組成成分數(shù)量(mg/L)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2煙酸0.5MnSO4·4H2O22.3鹽酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25鹽酸硫銨等0.4CoCl2·6H2O0.025第41頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五表2

B5培養(yǎng)基的組成和配方組成成分數(shù)量(mg/l）組成成分數(shù)量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4

134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO4

3.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動素0.1Na2MoO4·2H20.252,4－D0.1－1.00.025鹽酸硫銨10Na2-EDTA37.3

CoCl2·6H2O第42頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五表3N6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO3

1.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5第43頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制：母液：欲配制液的濃縮液。一般母液配成比所需濃度高10～100倍。大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類母液等。配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高的化學純或分析純。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。第44頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（一）母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標簽保存于冰箱母液配制(以MS為例)第45頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五母液種類種類成分規(guī)定用量(mg/L)擴大倍數(shù)稱取量(mg)母液定容體積(ml)配1LMS培養(yǎng)基吸取量(ml)

大量元素

KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4CaCI.2H2O19001650370170440

203800033000740034008800

1000

50微量元素MnSO4.4H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCI2.6H2O22.38.66.20.830.250.0250.025

100223086062083252.52.5

1000

10鐵鹽Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.327.810037302780100010有機物煙酸甘氨酸VB6VB1肌醇

50251005255000

500

100.520.50.1100第46頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五(二)母液配制要求：1、母液濃縮倍數(shù)：10-100，大量元素20；微量元素100、鐵鹽100；有機物50；2、選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學純試劑3、防止沉淀:

Ca2+和S042-，Ca2+Mg2+和PO43-4、激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100ml5、激素溶解：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；

2，4-D先溶于1mlNaOH再加水；

KT、BA先溶于1mlHCl再加水。

第47頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五四、培養(yǎng)基的配制：1、量取母液：營養(yǎng)元素和激素。2、稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi)，電路上加熱，使瓊脂溶化。3、加入母液，混合均勻，調(diào)整pH值。4、分裝入瓶，每瓶40－50ml。5、封口：用4－6層稱量紙封口，之后滅菌備用。第48頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五母液1100ml瓊脂7g母液210ml蔗糖30g

母液310ml

母液410mlBA2mgNAA1.5mg加熱定容1000ml用氧化鈉調(diào)PH5.8分裝（占容器1/4～1/3，不沾瓶壁口）高壓滅菌（121°C，1.1kg/cm2，20min）第49頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

大量元素母液

微量元素母液

鐵鹽母液

有機物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培養(yǎng)基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸進吸耳球里，數(shù)量看準，不滴不漏，吹凈為度。移母液第50頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為5.8。趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml,35瓶/L。調(diào)PH值：分裝：趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml,35瓶/L。第51頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五扎口與滅菌:要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應(yīng)及時滅菌，防止變質(zhì)。第52頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五五、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）：1、加熱：滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足，然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi)，改好蓋，關(guān)閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。2、排氣：當溫度升至0.05MPa時，打開放氣閥徹底排出鍋內(nèi)冷空氣。然后關(guān)閉放氣閥，促使壓力繼續(xù)上升。第53頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3、溫度控制：

當鍋內(nèi)壓力升至0.10MPa時，計時15－20分鐘，計時結(jié)束后，關(guān)閉電源。4、出鍋：

當滅菌鍋自然冷卻后，取出培養(yǎng)基，放置于接種室備用。第54頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五六、培養(yǎng)基的保存：1、防塵：防治灰塵污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒溫：4oC可保存3－6周，室溫下兩周內(nèi)用完。4、定期更新：不易長期保存。第55頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第三節(jié)植物離體培養(yǎng)體系的建立第56頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、植物組織培養(yǎng)的階段劃分：通常將組織培養(yǎng)過程劃分為四個階段

1、起始培養(yǎng)階段（誘導(dǎo)階段）

2、增殖培養(yǎng)階段

3、生根培養(yǎng)階段

4、馴化移栽第57頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第58頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（一）外植體的起始培養(yǎng)過程

1、起始培養(yǎng)的一般過程：

A、選取適宜的基因型（品種）；

B、選取適宜的外植體；常用外植體有莖尖、莖段、節(jié)間、葉片、葉柄等。

C、流水沖洗外植體；

D、外植體切割、分離及滅菌處理；

E、外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

F、環(huán)境條件控制促進外植體的生長。二、外植體起始培養(yǎng)（無菌體系建立）第59頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、接種外植體的生長過程：

A細胞分裂的啟動；

B細胞增殖；

C組織和器官的形成。

第60頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第61頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）影響外植體起始培養(yǎng)的因素：

1、影響外植體起始的因素

A

外植體

B

培養(yǎng)基組成成分

C培養(yǎng)條件第62頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五外植體：

(1)外植體種類及基因型

(2)外植體供體植株和外植體的來源與生理狀態(tài)

(3)外植體大小

(4)外植體的極性第63頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五外植體種類及基因型單子葉植物不易誘導(dǎo)器官發(fā)生。b.木本植物較難誘導(dǎo)。c.存在基因型差異（如番茄29%~63%）d.開始生長季節(jié)取材容易誘導(dǎo)。第64頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五外植體狀態(tài)：第65頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五外植體大小：外植體越小成苗能力越弱，較大的外植體增殖較快。外植體極性：當外植體以形態(tài)學的基部接種于培養(yǎng)基上時，從遠離基部的表面誘導(dǎo)出芽、苗數(shù)目較多。第66頁，共78頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五B、培養(yǎng)基

a培養(yǎng)基類型:b碳