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實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題xxx公司實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度材料和試劑：DMEM培養(yǎng)基，細胞板，中性紅，瓊脂糖，PBS或無抗無血培養(yǎng)基，1ml和10ml移液管等。操作步驟：1PK15細胞鋪細胞板，細胞密度要較高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有可能會形成很多層細胞，導(dǎo)致有的細胞形成病變的地方有其他層的細胞沒有壞死也被染色從而無法形成空斑）。2過夜后，用無抗無血的培養(yǎng)基清洗洗吧，然后再進行病毒吸附，原液進行10倍倍比稀釋，自己可以摸索一下感染稀釋度，一般病毒價較低的時候，可以降低稀釋度?？纯瞻咝纬汕闆r，要是空斑形成太大，連成片，就得增加稀釋度。3吸附1-2小時，用無抗無血培養(yǎng)基（或無菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆蓋液。使用%的瓊脂糖（加熱至液體狀）和兩倍DMEM溶液等體積混合，逐滴加到細胞板中。沒孔加入1-2ml覆蓋液。放置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4每天觀察細胞病變情況，出現(xiàn)明顯病變時進行二次覆蓋，覆蓋液和第一次差不多，只是要加入細胞染色液中性紅（%），一般體積比為10ml：10ml：1ml（可以適當(dāng)增加一點，如果染色效果不良的話）。5染色5H以上應(yīng)該就可以觀察染色情況，理論上偽狂犬病毒應(yīng)能形成白色空斑而PCV2不會產(chǎn)生空斑。在不知道PCV2在哪里的情況下，我們隨機挑取若干個沒有空斑的細胞，而后進行傳代。應(yīng)該可以得到無偽狂犬污染的PCV2病毒種。1蝕斑實驗需要細胞長至什么程度可以接毒？

顯微鏡下觀察，一般情況下，鋪滿細胞板底部即可，這樣不會造成空洞影響蝕斑觀察。不同的細胞不一樣，一般時候是長滿T25的細胞傳一個六孔板，第二天就接毒。

2細胞上用什么覆蓋物瓊脂瓊脂糖低熔點瓊脂糖濃度應(yīng)該是多大

我用的是lonza公司的低熔點瓊脂糖，終濃度是%。感覺不錯，就是挺貴的，2k+人民幣。

3如果做挑斑純化，是不是就不可以染色，染色后對毒力有何影響？

不染色就可以看出來，因為培養(yǎng)基本身里面就含有酚紅呈現(xiàn)顏色，形成的斑沒有顏色，可以直接挑斑；我也染色后挑過，感覺影響不大，可能不同病毒不一樣吧。

4由于細胞上有覆蓋物，那么該如何挑斑？

我用的是1ML

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