GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重組和基因工程1GeneticRecombinationandGe第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉移2第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉移2接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用(transduction)一、細菌的基因轉移與重組3接合作用(conjugation)轉化作用(transf（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。4（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒D55質?！?/p>

細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子6質粒——細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子6可接合質粒如F因子(Ffactor)

7可接合質粒如F因子(Ffactor)7（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用(transformation)。

8（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。9例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。91010（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。11（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例12λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑例121313（四）、轉座由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。14（四）、轉座由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉座15插入序列(insertionsequences,IS)組插入序列的復制性轉座16插入序列的復制性轉座16轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。

轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座17轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移由轉座子介導的轉座18由轉座子介導的轉座18在接合、轉化、轉導或轉座過程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價連接稱基因重組。二、基因重組同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)19在接合、轉化、轉導或轉座過程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價連一、同源重組(homologousrecombination)

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。20一、同源重組(homologousrecombinati2121以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。22以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的HollidHolliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)

23Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源片段重組體（見模型圖左邊產物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。24片段重組體（見模型圖左邊產物）：拼接重組體（見模型圖右邊

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′25內切酶DNA侵擾分支遷移內切酶DNA5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體26Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′二、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。27二、位點特異重組27設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出”蠶絲？設想二能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術——基因工程。定向基因改造設想28設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐基因工程的原理操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因(或DNA片段）DNA水平剪切→拼接→導入→表達人類需要的新的生物類型基因產物基因重組DNA重組技術是基因工程的核心技術29基因工程的操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉30重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique31第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinat一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』?cloning)獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）DNA克隆32一、重組DNA技術相關概念克隆(cl(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆

(2)細胞克隆；(3)個體克隆（動物或植物）。

重組水平:33(1)分子克隆(molecularclone),即DNADNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

34DNA克隆341.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達二、重組DNA技術基本過程351.目的基因的獲取二、重組DNA技術基本過程35基因工程的工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶36基因工程的工具酶限制性核酸內切酶36限制性核酸內切酶“分子手術刀”限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。限制酶Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。37限制性核酸內切酶“分子手術刀”限制性核酸內切酶(r作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。38作用38細菌的限制性核酸內切酶DNA普通內切酶DNA細菌限制性內切酶GAATTCCTTAAG在特定部位實施內切。粘性末端被核酸外切酶降解細菌自身DNA甲基保護GAATTCCTTAAGCH3CH3不工作這種限制性核酸內切酶有何用呢？打擊入侵的敵人39細菌的限制性核酸內切酶DNA普通內切酶DNA細菌限制性內切酶噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點無甲基保護，將被降解。40噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點無甲基保護，將被降解。40第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名EcoRⅠ

屬

種

株

序Escherichiacoli

RY13株大腸桿菌RY13株的第一種酶41第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；命名EcoRⅠ第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶42第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；HindⅢ分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）已經發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種43分類已經發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種43Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG44Ⅱ類酶識別序列特點——回文結構(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口45BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。黏性末端46被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，EnzymesinvolvedinDNAcloning

Restrictionendonucleases(II)

EcolRⅠPstⅠSmalⅠ47EnzymesinvolvedinDNAclonin同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ48同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA49同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基50重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功1、目的基因cDNA(complementaryDNA)

體外反轉錄合成的、與mRNA互補的DNA基因組DNA(genomicDNA)

代表一個細胞/生物體整套遺傳信息的所有DNA序列（一）目的基因的獲取511、目的基因cDNA(complementaryDNA)1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

2、目的基因的獲取方法521.化學合成法2、目的基因的獲取方法52*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列53*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序分子文庫基本策略

54分子文庫基本策略

545555變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈PCR的基本反應步驟：56變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNAPC2、克隆載體的選擇與構建基因載體：是運送目的基因片段進入宿主細胞的DNA分子，——“分子運輸車”。572、克隆載體的選擇與構建基因載體：是運送目的基因片段進入宿主（1）能夠自我復制，并帶動插入的外源基因一起復制（2）具有合適的限制性酶切位點（多克隆位點，外源DNA插入點）（3）具有合適的篩選標記（4）細胞內拷貝數要多（5）載體的分子量要小，以容納較大的外源DNA。（6）細胞內穩(wěn)定性高作為運載體必須具備哪些條件？常用的載體：細菌質粒、l噬菌體、cosmid質粒等。58（1）能夠自我復制，并帶動插入的外源基因一起復制作為運載體必

質粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的環(huán)狀DNA分子。進入到宿主細胞中的一個質?？梢源罅吭黾悠淇截悢怠?.質粒

(plasmid)59質粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的環(huán)狀DN質粒載體

的一般結構60質粒載體

的一般結構60λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列61λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬3.粘性質粒(cosmid)623.粘性質粒(cosmid)62酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他63酵母人工染色體其他63克隆載體(cloningvector)

用于目的基因的克隆、擴增、序列分析和體外定點突變表達載體(expressionvector)

在宿主細胞中表達外源目的基因，獲得大量表達產物載體類型根據具體實驗需要選擇載體64克隆載體(cloningvector)載體類型根據具體實驗6565（三）外源基因與載體切割與連接催化連接反應的酶：DNA連接酶66（三）外源基因與載體切割與連接催化連接反應的酶：DNA連接酶DNA連接酶使一段DNA的3’-羥基末端與另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-磷酸二酯鍵，使單鏈DNA缺口封合或使兩個DNA片斷連接成一個片斷——“分子縫合針”67DNA連接酶使一段DNA的3’-羥基末端與另一段DNA的5’根據酶的來源不同，分為兩類：1.E.coliDNA連接酶：大腸桿菌，只能連接互補的粘性末端。2.T4連接酶：T4噬菌體，既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的粘性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。68根據酶的來源不同，分為兩類：68方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接1.粘性末端連接69方式：(1)同一限制酶切位點連接1.粘性末端連接69BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接70BamHⅠ切割反應GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。71不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端722.平端連接72目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連73目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。743.同聚物加尾連接745′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體755′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

764.人工接頭(linker)連接76人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ77人工接頭及其應用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco受體菌條件安全宿主菌：防止感染限制酶和重組酶缺陷：避免修飾、降解和重組整合處于感受態(tài)(competent)

（四）重組DNA導入受體菌78受體菌條件（四）重組DNA導入受體菌78大腸桿菌酵母昆蟲細胞哺乳動物細胞宿主菌或受體細胞感受態(tài)細胞（competentcell）79大腸桿菌宿主菌或受體細胞感受態(tài)細胞（competentc導入方式轉化(transformation)：大腸桿菌轉染(transfection)：真核細胞感染(infection)（轉導）：病毒80導入方式80CaCl2處理受體細菌0.1MCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉入細菌容易接受外源DNA的狀態(tài)感受態(tài)細胞81CaCl2處理受體細菌0.1MCaCl2感受態(tài)細菌重組體8282

(1)

抗藥性標記選擇

(2)標志補救(markerrescue)核酸雜交篩選法

原位雜交

Southern印跡PCR/DNA序列鑒定外源基因表達產物鑒定：SDS、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等遺傳標志篩選法（五）重組體的篩選83(1)抗藥性標記選擇核酸雜交篩選法遺傳標(插入失活法)抗藥性標記選擇84(插入失活法)842）標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段852）標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COX-galLacZ藍色化合物X-gal86X-galLacZ藍色化合物X-gal86α互補的檢測87α互補的檢測878888原位雜交89原位雜交89Southern印跡紀念發(fā)明者EdwardSouthern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析90Southern印跡紀念發(fā)明者EdwardSouthern9191瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅動力和凝膠阻力

——不同遷移率分子量標準參照物

酶切和電泳方法92瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：酶切和電泳方法凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質粒重組質粒

重組質粒酶切重組質粒的PCR擴增片段93凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質粒重組質粒9494分：分離目的基因切：對目的基因和載體適當切割接：目的基因與載體連接轉：重組DNA轉入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體DNA克隆的基本過程小結95分：分離目的基因DNA克隆的基本過程小結95重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交96重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達97表達體系的建立（六）克隆基因的表達971.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白981.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）98優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、不經濟轉染

——

將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射

2.真核表達體系

酵母、昆蟲、乳類動物細胞99優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA轉染——將表表達載體pFASTBACI的物理圖譜100表達載體pFASTBACI的物理圖譜100101101三、重組技術與醫(yī)學的關系疾病相關基因分析制造生物活性蛋白質基因診斷與基因治療遺傳疾病的預防102三、重組技術與醫(yī)學的關系疾病相關基因分析102

重組DNA醫(yī)藥產品產品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂103重組DNA醫(yī)藥產品產品功能組織胞漿素原激基因治療基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。104基因治療104重癥聯(lián)合性免疫缺陷綜合癥（SCIDs）。腺苷脫氨酶（ADA）105重癥聯(lián)合性免疫缺陷綜合癥（SCIDs）。腺苷脫氨酶（ADA1.產前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性遺傳疾病的預防1061.產前診斷遺傳疾病的預防106小結基本概念：限制性核酸內切酶基因工程的基本過程：分，切，接，轉，篩，表達理想質粒載體的特點107小結基本概念：限制性核酸內切酶107

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重組和基因工程108GeneticRecombinationandGe第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉移109第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉移2接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用(transduction)一、細菌的基因轉移與重組110接合作用(conjugation)轉化作用(transf（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。111（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒D1125質粒——

細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子113質?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子6可接合質粒如F因子(Ffactor)

114可接合質粒如F因子(Ffactor)7（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用(transformation)。

115（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。116例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。911710（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。118（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例119λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑例1212013（四）、轉座由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。121（四）、轉座由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉座122插入序列(insertionsequences,IS)組插入序列的復制性轉座123插入序列的復制性轉座16轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。

轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座124轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移由轉座子介導的轉座125由轉座子介導的轉座18在接合、轉化、轉導或轉座過程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價連接稱基因重組。二、基因重組同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)126在接合、轉化、轉導或轉座過程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價連一、同源重組(homologousrecombination)

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。127一、同源重組(homologousrecombinati12821以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。129以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的HollidHolliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)

130Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源片段重組體（見模型圖左邊產物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。131片段重組體（見模型圖左邊產物）：拼接重組體（見模型圖右邊

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′132內切酶DNA侵擾分支遷移內切酶DNA5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體133Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′二、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。134二、位點特異重組27設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出”蠶絲？設想二能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術——基因工程。定向基因改造設想135設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐基因工程的原理操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因(或DNA片段）DNA水平剪切→拼接→導入→表達人類需要的新的生物類型基因產物基因重組DNA重組技術是基因工程的核心技術136基因工程的操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉137重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique138第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinat一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』?cloning)獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）DNA克隆139一、重組DNA技術相關概念克隆(cl(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆

(2)細胞克??；(3)個體克隆（動物或植物）。

重組水平:140(1)分子克隆(molecularclone),即DNADNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

141DNA克隆341.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達二、重組DNA技術基本過程1421.目的基因的獲取二、重組DNA技術基本過程35基因工程的工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶143基因工程的工具酶限制性核酸內切酶36限制性核酸內切酶“分子手術刀”限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。限制酶Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。144限制性核酸內切酶“分子手術刀”限制性核酸內切酶(r作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。145作用38細菌的限制性核酸內切酶DNA普通內切酶DNA細菌限制性內切酶GAATTCCTTAAG在特定部位實施內切。粘性末端被核酸外切酶降解細菌自身DNA甲基保護GAATTCCTTAAGCH3CH3不工作這種限制性核酸內切酶有何用呢？打擊入侵的敵人146細菌的限制性核酸內切酶DNA普通內切酶DNA細菌限制性內切酶噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點無甲基保護，將被降解。147噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點無甲基保護，將被降解。40第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名EcoRⅠ

屬

種

株

序Escherichiacoli

RY13株大腸桿菌RY13株的第一種酶148第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；命名EcoRⅠ第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶149第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；HindⅢ分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）已經發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種150分類已經發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種43Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG151Ⅱ類酶識別序列特點——回文結構(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口152BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。黏性末端153被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，EnzymesinvolvedinDNAcloning

Restrictionendonucleases(II)

EcolRⅠPstⅠSmalⅠ154EnzymesinvolvedinDNAclonin同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ155同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA156同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基157重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功1、目的基因cDNA(complementaryDNA)

體外反轉錄合成的、與mRNA互補的DNA基因組DNA(genomicDNA)

代表一個細胞/生物體整套遺傳信息的所有DNA序列（一）目的基因的獲取1581、目的基因cDNA(complementaryDNA)1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

2、目的基因的獲取方法1591.化學合成法2、目的基因的獲取方法52*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列160*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序分子文庫基本策略

161分子文庫基本策略

5416255變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈PCR的基本反應步驟：163變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNAPC2、克隆載體的選擇與構建基因載體：是運送目的基因片段進入宿主細胞的DNA分子，——“分子運輸車”。1642、克隆載體的選擇與構建基因載體：是運送目的基因片段進入宿主（1）能夠自我復制，并帶動插入的外源基因一起復制（2）具有合適的限制性酶切位點（多克隆位點，外源DNA插入點）（3）具有合適的篩選標記（4）細胞內拷貝數要多（5）載體的分子量要小，以容納較大的外源DNA。（6）細胞內穩(wěn)定性高作為運載體必須具備哪些條件？常用的載體：細菌質粒、l噬菌體、cosmid質粒等。165（1）能夠自我復制，并帶動插入的外源基因一起復制作為運載體必

質粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的環(huán)狀DNA分子。進入到宿主細胞中的一個質粒可以大量增加其拷貝數。1.質粒

(plasmid)166質粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的環(huán)狀DN質粒載體

的一般結構167質粒載體

的一般結構60λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列168λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬3.粘性質粒(cosmid)1693.粘性質粒(cosmid)62酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他170酵母人工染色體其他63克隆載體(cloningvector)

用于目的基因的克隆、擴增、序列分析和體外定點突變表達載體(expressionvector)

在宿主細胞中表達外源目的基因，獲得大量表達產物載體類型根據具體實驗需要選擇載體171克隆載體(cloningvector)載體類型根據具體實驗17265（三）外源基因與載體切割與連接催化連接反應的酶：DNA連接酶173（三）外源基因與載體切割與連接催化連接反應的酶：DNA連接酶DNA連接酶使一段DNA的3’-羥基末端與另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-磷酸二酯鍵，使單鏈DNA缺口封合或使兩個DNA片斷連接成一個片斷——“分子縫合針”174DNA連接酶使一段DNA的3’-羥基末端與另一段DNA的5’根據酶的來源不同，分為兩類：1.E.coliDNA連接酶：大腸桿菌，只能連接互補的粘性末端。2.T4連接酶：T4噬菌體，既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的粘性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。175根據酶的來源不同，分為兩類：68方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接1.粘性末端連接176方式：(1)同一限制酶切位點連接1.粘性末端連接69BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接177BamHⅠ切割反應GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。178不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端1792.平端連接72目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連180目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。1813.同聚物加尾連接745′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體1825′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

1834.人工接頭(linker)連接76人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ184人工接頭及其應用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco受體菌條件安全宿主菌：防止感染限制酶和重組酶缺陷：避免修飾、降解和重組整合處于感受態(tài)(competent)

（四）重組DNA導入受體菌185受體菌條件（四）重組DNA導入受體菌78大腸桿菌酵母昆蟲細胞哺乳動物細胞宿主菌或受體細胞感受態(tài)細胞（competentcell）186大腸桿菌宿主菌或受體細胞感受態(tài)細胞（competentc導入方式轉化(transformation)：大腸桿菌轉染(transfection