普通PCR技術(shù)熒光定量方法產(chǎn)品選購(gòu)指南實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案常規(guī)PCR技術(shù)常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析S1S2MDNA

Engine實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法;如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光域值、Ct值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光PCR熒光曲線圖---循環(huán)數(shù)，熒光值---指數(shù)擴(kuò)增期，非指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增產(chǎn)物熒光曲線指數(shù)擴(kuò)增期非指數(shù)擴(kuò)增期域值（Threshold）線——熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）C(t)（CountofThreshold）值——熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)域值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)域值線C

(t)值C(t)值：對(duì)于同一PCR反應(yīng)而言，模板濃度相同時(shí)，C(t)值極具重復(fù)性；對(duì)于同一PCR反應(yīng)而言中，模板濃度越高，到達(dá)某一域值時(shí)對(duì)應(yīng)的C(t)值就越小，反之，則越高；在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)，初始模板的Log濃度與C(t)值呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)[即C(t)值]就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量方法：初始模板量的對(duì)數(shù)與C(T)循環(huán)數(shù)之間呈線性關(guān)系10610510410310210常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增

產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較優(yōu)勢(shì)來自：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物濃度實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR凝膠電泳分析終產(chǎn)物通過終產(chǎn)物定性分析模板熒光實(shí)時(shí)分析每一次循環(huán)產(chǎn)物精確計(jì)算初始模板濃度，靈敏度高，檢測(cè)單拷貝模板計(jì)算機(jī)自動(dòng)

分析檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力熒光定量方法法使用內(nèi)摻式

---- SYBR

Green

I探針法使用序列特異性探針----

Taqman----

Molecular

Beacons----

DualProbes(FRET)3’5’3’5’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green

ISYBR-Green

I

的優(yōu)點(diǎn)使用方便－－不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物沒有序列特異性－－可以用于不同的模板與常規(guī)儀器兼容－－可用300-495nm的任何類型的光源激發(fā)適合高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)價(jià)格便宜靈敏度高SYBR-Green

I

的缺點(diǎn)容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性(但可以通過融解曲線分析，優(yōu)化反應(yīng)條件)對(duì)引物特異性要求較高SYBR

Green

I

融解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度SYBR

Green

I

融解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTm融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量

確非特異性產(chǎn)物SYBR

Green

I

法的應(yīng)用范圍型的分析起始模板的測(cè)定?

融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。與目標(biāo)序列互補(bǔ)5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R),如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan探針---水解型雜交探針3’5’3’5’5’3’5’3’QExcitationExcitation雙標(biāo)記探針（Taqman

Probe）TaqMan探針優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列的高特異性------

結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好與Molecular

Beacons

相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針不能進(jìn)行融解曲線分析Taqman的應(yīng)用定量起始模板濃度型分析產(chǎn)物鑒定SNP分析ExcitationEmission分子信標(biāo)（Molecular

Beacon

Probe）分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性---用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一熒光背景低分子信標(biāo)的缺點(diǎn)設(shè)計(jì)無終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高分子信標(biāo)的應(yīng)用定量起始模板濃度型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)ExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞（FRET

Probe）小

結(jié)性質(zhì)特異性通用性探針非特異性檢測(cè)熒光SYBR可逆熒光引物(非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響)通用不需要擴(kuò)增序列專一檢測(cè)熒光探針法Taqman(包括MGB技術(shù))積累熒光引物+探針需要FRET一般實(shí)時(shí)熒光引物+雙探針需要Amplisensor分子信標(biāo)(molecularbeacon)積累熒光引物+探針需要熒光標(biāo)記引物蝎型引物(scorpionprimer)積累熒光引物不需要Amplifluor積累熒光引物通用不需要相關(guān)產(chǎn)品QIAGEN-Operon:

定量引物，探針QIAGEN:

預(yù)

的探針引物QIAGEN:

定量PCR試劑盒

（

法/探針法）BIO-RAD:

定量PCR

SuperMix其他:

Applied

Biosystems

(ABI)，F(xiàn)innzymes，RocheApplied

Science，Stratagene，Invitrogen，New

EnglandBiolabs，Sigma-Aldrich

;(在

輸入qPCR即可查到產(chǎn)品信息）Tect

SYBR

Gree R/

RT-PCR

Kit

試劑盒內(nèi)含嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒釂?dòng)酶HotStarTaqDNA

Ploymerase，ROX參比

，dNTPs和優(yōu)化的緩沖體系，確保高特異性和高靈敏度以預(yù)混液形式提供，使用方便,

無需優(yōu)化適用于各種定量PCR儀（這些儀器包括：ABI

PRISM，Applied

Biosystems，LightCycler，iCycler

iQ，DNA

Engine

Opticon,

Mx4000,

Mx3000P）規(guī)格：40次/200次/1000次反應(yīng)（50ul體系）Qiagen

定量PCR試劑Tect

Probe

PCR/

RT-PCR

Kit適用于Real-time

RT-PCR和兩步法RT-PCR，使用序列特異性探針熱啟動(dòng)酶HotStarTaq

DNA

Ploymerase獨(dú)特緩沖液逆轉(zhuǎn)錄酶Omniscript和Sensiscript的混合物特點(diǎn):確保高特異性和高靈敏度使用簡(jiǎn)單，無需優(yōu)化以預(yù)混液形式提供，使用方便適用于各種定量PCR儀，兼容各種序列特異性探針Tect

Multiplex

PCR

Kit多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行定量，本產(chǎn)品在一個(gè)反應(yīng)中對(duì)最多4個(gè)模板同時(shí)進(jìn)行定量分析。可以大大提高精度并節(jié)約成本。采用專利的MP因子，可以增加模板附近的引物的局部濃度。節(jié)約成本----節(jié)省試劑，節(jié)省樣本，節(jié)省時(shí)間。提高精度----

避免加樣誤差和反應(yīng)間誤差。特點(diǎn):無需優(yōu)化–試劑和操作步驟都經(jīng)過了預(yù)先優(yōu)化高靈敏度–可檢測(cè)到10copy的目標(biāo)序列定量準(zhǔn)確可靠

–

目標(biāo)

和參照

在一個(gè)反映體系中擴(kuò)增，消除了加樣誤差和反應(yīng)間誤差導(dǎo)致的結(jié)果誤差操作簡(jiǎn)單–預(yù)制好的master

mixes可以和各種熒光定量PCR儀配套使用適用于各種PCR儀（ABI

PRISM，Applied

Biosystems，iCycler

iQ，LightCycler2.0，DNA

Engine

Opticon

2，Mx4000，Mx3000P，SmartCyclerⅡ）Tect

Multiplex

PCR

KitTect

Multiplex

PCR

Kit應(yīng)用表達(dá)研究型分析----GMO.

微生物鑒定，RNAi后期驗(yàn)證試劑盒里面帶有ROX,最多作3個(gè)204543（200）

-

RMB8883204545

（1000）

-

RMB35505Cost:

35.5-44.4RMB/Run-------如果一次做3個(gè),則每個(gè)只需11.8-14.8RMBTect

Multiplex

PCR

KitBio-Rad

Supermix

系列IQ

SupermixiTaq熱啟動(dòng)DNA聚合酶（抗體介導(dǎo)）

,dNTPs,緩沖液濃度最適合實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，使用方便；只需模板、引物、探針；可與iCycler

iQ

和MyiQ實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)配合使用IQ

SYBR Green

SuperMix優(yōu)化的緩沖液保持SYBR

GreenⅠ

的穩(wěn)定性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠?jī)?yōu)化的SYBR

GreenⅠ

濃度，確保檢測(cè)靈敏而精確使用方便，只需模板和引物iTaq

SYBR

Green

ROX

/

iTaq

Supermix

with

ROX專利低

配方，吸取更方便可用于所有需要ROX的光學(xué)PCR儀平臺(tái)方便的單管配方，預(yù)混有ROX和dUTP比同類產(chǎn)品穩(wěn)定的產(chǎn)生更早的Ct值,結(jié)果高度均一iScript

One-Step

RT-PCR

KitWith

SYBR

GreenⅠ/

Probes適用于一步法RT-PCR，使用SYBRGreenⅠ或探針檢測(cè)檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1pgiScript

反轉(zhuǎn)錄酶、iTaq

DNA

聚合酶定量PCR耗材Axygen

/

Bio-rad0.2ml

PCR八排管0.2ml

PCR八排管蓋96孔PCR板96孔PCR板（半邊）,用于ABI-3100PCR板膜吸頭類定量PCR實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化（使用SYBR

GreenⅠ）:SYBR

Green

Ⅰ使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)Primer：要求引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,

以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer

體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同TaqMan探針PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃，<30

bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400

bp

，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94

℃，10-20S;60℃，30-60S（Taq酶5′-3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度;72

℃，45

S;3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM其他與常規(guī)PCR相同RNA提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR步驟RNA的質(zhì)