手足口病的病原學及其診斷許文波中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家麻疹/脊灰實驗室2009-03-30第1頁，共39頁?！案逢?3例不明原因肺炎死亡病例”病例高度散發(fā)不具有傳染性，可能為感染性疾病沒有疹子或疹子不典型以“重癥肺炎”為主要臨床表現(xiàn)病情進展迅速，大部分入院幾小時-2天死亡病因不明EV71感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的心肺衰竭“疫情概況”第2頁，共39頁。阜陽<不明原因肺炎>死亡病原學鑒定4月18，中國CDC組織專家組流行病學臨床資料實驗室檢測EV71是此次疾病的主要致病原證實4月23日分析判定病原和實驗室檢測方向為=HEV71第3頁，共39頁。手足口病

第38種需上報的傳染性疾病2008.05.02手足口病皮疹分布

1.頰粘膜和手指;2.手掌

3.足底

4.唇粘膜

5.咽峽炎12345第4頁，共39頁。2008年中國大陸手足口病報告人數(shù)總共報告489073例病例，發(fā)病率為37.01/100,000嚴重病例1165例，占報告病例數(shù)的0.24%死亡126例，死亡率為0.0095/100,000，死亡病例占總病例0.26‰傳染病疫情網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析第5頁，共39頁。人腸道病毒簡介和分類小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成員，主要在腸道內(nèi)復制,但可感染各個系統(tǒng)和器官。單正鏈的無包膜RNA病毒，RNA有感染性。小球形病毒（~30nm），20面體對稱結(jié)構(gòu)。衣殼有VP1-VP4四種蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4與內(nèi)部RNA結(jié)合。與鼻病毒不同的是，它們在酸性環(huán)境中穩(wěn)定。在胞漿增殖，有明顯CPE，破胞釋放。引起多種疾?。郝楸孕约膊　o菌性腦膜炎、心肌損傷、手足口病，結(jié)膜炎，皮疹等。第6頁，共39頁。CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h~30nm二十面體對稱無包膜人腸道病毒的毒粒結(jié)構(gòu)第7頁，共39頁。脊髓灰質(zhì)炎病毒：通過將標本接種至猴子體內(nèi)，1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)?？滤_奇病毒：1948年在美國紐約Coxsackie鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標本接種至乳鼠體內(nèi)，分離出來的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們在乳鼠上產(chǎn)生的組織病理學變化和在細胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。?？刹《荆?951年在一名無癥狀的兒童的糞便標本中分離到，在細胞培養(yǎng)上可以造成致細胞病變，但對乳鼠和靈長類動物不致病。新腸道病毒：后來，新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號命名（69~71），最近，已經(jīng)命名至102型人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史第8頁，共39頁。人腸道病毒傳播方式>糞-口途徑傳播:唾液與糞便>呼吸道傳播:空氣飛沫接觸傳播:第9頁，共39頁。環(huán)境因素影響經(jīng)水傳播的病原體

河流海洋排毒水海產(chǎn)品污水處理廠休閑、娛樂直接、間接接觸（院內(nèi)）灌溉盤子門把手洗針對脊灰病毒、NPEV、輪狀病毒、諾如病毒，甲肝第10頁，共39頁。手足口?。╤and-foot-mouthdisease，HFMD）

為全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有流行的報道。1957年在加拿大首次報告，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病病原；1959年提出HFMD命名，HFMD在全球廣泛流行，無明顯的地域分布。之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞虴V71引起的手足口病流行。發(fā)熱,不適,咽喉腫痛,口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡傳染性極高病程約1周第11頁，共39頁。HFMD的病原手足口病可由多種腸道病毒所引起，其中包括

CoxA5,A10,A16,A19,EV71,以及部分?？刹《竞涂滤_奇B組病毒,以CoxA16和EV71最為常見傳播途徑:糞-口途徑傳播:唾液與糞便;

呼吸道傳播:空氣飛沫;

接觸傳播

皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。

HFMD為全球性傳染病，在全球廣泛分布，無明顯的地域分布,但近年EV71在東南亞一帶流行,引起較多的重癥和死亡病例。在80年代和90年代，中國手足口病的流行主要以

CoxA16為主，2008年，CoxA16和EV71共循環(huán)引起手足口病爆發(fā),EV71在大部分省市為優(yōu)勢病毒。

第12頁，共39頁。腸道病毒CoxA16

1957年在加拿大首次報告HFMD，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病病原；1959年提出HFMD命名，之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《镜纫鸬氖肿憧诓〉?3頁，共39頁。屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，A組腸道病毒。1972年EV71在美國被首次確認，1974年Schmidt等首次發(fā)表從美國加利福尼亞州20例具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者（1969~1973年）中分離到EV71。隨后，世界上眾多國家都有EV71流行的報道。EV71感染可引起HFMD、皰疹性咽峽炎、無菌性腦炎、腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，但更多情況下是產(chǎn)生隱性感染。同脊灰病毒相似，EV71對脊髓前角細胞具有一定的組織嗜性，是最常見的引起急性遲緩性麻痹（acuteflaccidparalysis，AFP）的非脊灰腸道病毒（non-polioenterovirus，NPEV）,EV71潛伏期一般為3－7天。感染EV71后，患者發(fā)病1~2周內(nèi)可自咽部排出病毒，從糞便中排毒可持續(xù)至發(fā)病后3~5周。皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。

腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）第14頁，共39頁。雖然EV71最初分離于具神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者，曾在澳大利亞、歐洲、亞洲和美國引起嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而近年來，EV71則多與HFMD的暴發(fā)相關(guān)，并在暴發(fā)中引起患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至死亡。1975年保加利亞44個嬰幼兒死于HFMD20世紀90年代后期，EV71開始肆虐東亞地區(qū)。1997年馬來西亞發(fā)生了主要由EV71引起的手足口病流行，4～8月共有2628例發(fā)病，僅4～6月就有29例病人死亡，死者平均年齡1.5歲。1998年我國臺灣省發(fā)生EV71引起的手足口病和皰疹性咽峽炎暴發(fā)流行，在6月和10月兩波流行中，共監(jiān)測到129106例，重癥病人405例，死亡78例，死亡病例大多為5歲以下的兒童，并發(fā)癥包括腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性遲緩性麻痹和心肌炎等。第15頁，共39頁。人腸道病毒感染的一般致病機制進入途徑口腔/呼吸道咽喉及下腸胃道傳播扁桃體、深層淋巴結(jié)、腸道淋巴結(jié)微病毒血癥先天性感染神經(jīng)系統(tǒng)心臟肝臟、胰臟、腎上腺呼吸系統(tǒng)皮膚及黏膜病毒血癥神經(jīng)系統(tǒng)抗體產(chǎn)生、病毒血癥消失，病毒感染癥狀改善飛沫、接觸、飲食肌肉第16頁，共39頁。①隱性感染多見，很少引起腹瀉，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。

②病毒在機體腸道中增殖，很少引起腸道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染。③不同人腸道病毒可引起相同癥狀，同一種人腸道病毒可引起不同臨床表現(xiàn)。④感染過程中形成病毒血癥。致病特點第17頁，共39頁。

中國HFMD的流行1981年，我國在上海首次報道了HFMD病例1987年在中國分離到CVA161995年以來，我國陸續(xù)在武漢、深圳、上海、重慶、山東和安徽等地的HFMD患者中分離到EV71病毒。2007年，山東發(fā)生了手足口病爆發(fā)流行，累計報告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。實驗室檢測發(fā)現(xiàn)EV71是引起山東臨沂HFMD的主要病原，同時還檢測到Echo3和/或CVA16。2008年全國出現(xiàn)HFMD爆發(fā)流行,以HEV71為優(yōu)勢,CVA16還有其它EV共循環(huán)引起第18頁，共39頁。EV71毒株各個基因型/亞型流行的地理和年代分布基因型流行地區(qū)流行時間A美國1970B1美國、澳大利亞、中國臺灣、匈牙利、保加利亞、日本1972~1987B2美國、1981~1987B3馬來西亞、澳大利亞、新加坡1997~1999B4馬來西亞、新加坡、中國臺灣、日本1997~2002B5馬來西亞2003C1美國、澳大利亞、馬來西亞、新加坡、越南、泰國、日本1986~2005C2美國、澳大利亞、日本、中國臺灣、1995~2002C3中國、韓國1997、2003C4中國、越南、日本、中國臺灣1998~2007C5越南2005第19頁，共39頁。（一）糞便標本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5～8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（二）腦脊液標本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標本，進行病原和抗體檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3日內(nèi)，采集量為1.0～2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（三）血清標本采集急性期(發(fā)病0～5天)和恢復期(發(fā)病14～30天)雙份配對血清用于抗體檢測。檢測IgM時，采集(發(fā)病7～20天)血。靜脈采集3～5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于－20℃以下冰箱中冷凍保存。標本采集種類、運輸和保藏-HFMD第20頁，共39頁。（四）咽拭子標本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5ml保存液（細胞維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（五）皰疹液可同時采集多個皰疹作為一份標本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。第21頁，共39頁。手足口病病例標本采集要求病人類型標本類型采集時間樣本量保存運送死亡病例腦干組織肺組織等血液死亡后不低于20克血液不低于2ml-70C冷藏重癥、輕型病例血清急性期（5天內(nèi)）1ml-70C冷藏發(fā)病后5～15天1ml發(fā)病3周后1ml咽拭子急性期1ml糞便急性期1份皰疹液有皰疹時1份備注：（1）采集新發(fā)或新入院病人的相關(guān)標本；（2）樣品采集時，如果標本需分裝或分地檢測，注意適當增加單份樣品采集量；（3）采樣時，做好樣品登記工作，詳細記錄病人姓名、性別、年齡、發(fā)病時間、出疹時間，采樣時間、主要臨床表現(xiàn)、是否用藥等信息，并注意和個案調(diào)查資料相匹配。第22頁，共39頁。

用于病毒分離的標本包括糞便、咽拭子和皰疹液如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，應該采集腦脊液標本。在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離病毒具有很高的診斷價值。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防干燥。為了保證檢測結(jié)果的準確性和有效性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采集，恢復期血清在發(fā)病2-4周后采集。標本采集注意事項第23頁，共39頁。

加強HFMD病原檢測和監(jiān)測的十分必要

依據(jù)臺灣1998-2008和中國大陸2007-2008年的經(jīng)驗掌握手足口病病原譜，特別是EV71感染所占的比例，對分析判斷HFMD疫情導致重癥和死亡的比例有重要的科學參考價值。1998年臺灣手足口病暴發(fā)疫情中，在48.7%輕癥病例中、75％住院病例中、92％死亡病例中均分離到HEV71。2.2007年山東臨沂發(fā)生了手足口病暴發(fā)，有8例死亡病例，手足口病的病原譜構(gòu)成中，HEV71約占84%，CVA16約占16%；2008年當?shù)厥肿憧诓〔±龜?shù)仍較高，但病原譜發(fā)生較大的變化，病毒毒株是以CVA16為主（占62％）,并且沒有重癥死亡病例。3.2008年阜陽HEV71手足口病99％以上有是第24頁，共39頁。手足口病的病原構(gòu)成比例

(實驗室EMAIL統(tǒng)計)

嚴重病例：EV71占實驗室確診的嚴重病例的81.59％死亡病例：EV71占實驗室確診的死亡病例的96.43％第25頁，共39頁。手足口病的診斷一般是通過采集適當?shù)呐R床標本后進行基因檢測、抗原檢測、血清學抗體檢測、病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合格的臨床標本，或無法進行實驗室檢測。很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時期腸道病毒的流行株也不同。通常用于腸道病毒分離的細胞系為RD、HEp-2、Vero等，聯(lián)合使用上述的兩種或更多細胞有助于分離到更多的腸道病毒。手足口病的實驗室檢測第26頁，共39頁。病毒實驗室檢測類型-病毒實驗室診斷方法檢測抗體/抗原檢測病毒檢測核酸ELISA/HI/PA蛋白印跡免疫熒光病毒分離ELISA中和試驗電鏡基因芯片中和試驗RT-PCR實時熒光定量PCR套式PCRLAMP免疫熒光基因芯片每種方法各有優(yōu)勢,依據(jù)病毒來定檢測策略Newmoleculartoolsforepidemiologystudiesanddiagnosis第27頁，共39頁。待檢標本病毒分離CPE陽性RT-PCR及序列測定腸道病毒非腸道病毒測雙份血清中和抗體滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR檢測病毒核酸序列測定無CPE常規(guī)實驗補充實驗中和定型手足口病的實驗室檢測流程見下圖：第28頁，共39頁。實驗室診斷原則人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應對血清診斷及病原診斷的實驗室結(jié)果作嚴格評價，必須結(jié)合臨床癥狀及環(huán)境因素流行病學分析，以確立病毒與疾病的病原學關(guān)系。一般采取的原則為：（1）病毒分離陽性率遠高于對照人群；（2）病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；（3）從病變組織中分離出病毒或檢測到病毒核酸。第29頁，共39頁。病毒疾病常出現(xiàn)的陰性結(jié)果分析>病毒培養(yǎng)：

-標本采集時間太遲

-標本采集部位錯誤

-標本采集技術(shù)不過關(guān)

-標本保存不好

-病毒培養(yǎng)細胞株選擇錯誤

-實驗室質(zhì)量控制

-其他>血清抗體：

-血清標本采集時間不對

-非特異性抑制物質(zhì)干擾

-抗體反應微弱：抗原變異

-病毒或病毒株選擇錯誤

-檢測方法錯誤

-實驗室質(zhì)量控制：

-其他第30頁，共39頁。造成人腸道病毒感染與流行的因素宿主因素：營養(yǎng)、衛(wèi)生、抵抗力病毒的種類侵入易感個體的人腸道病毒量病毒的毒性強弱整個族群里含有抗體的個體（群體免疫）少數(shù)研究：特定HLA基因較易出現(xiàn)肢體麻痹癥候群有些研究：新生兒與嬰兒易遭受嚴重的柯薩奇B型、ECHO和EV71病毒感染第31頁，共39頁。人腸道病毒感染后的病程816816感染00天2424病毒分離糞便糞便咽拭CSF血清雙份血抗體傳染性臨床特征糞-口2-7(10)天第32頁，共39頁。人腸道病毒病例死亡時間死亡機率心衰竭早期死亡14>28天神經(jīng)系統(tǒng)損傷腦死亡及中樞衰竭123456呼吸衰竭晚期死亡第33頁，共39頁。5，與人腸道病毒感染相關(guān)的疾病癥狀脊灰

CoxA

CoxB

Echo麻痹性疾病++++腦膜炎-腦炎++++心肌炎++++新生兒疾病--++胸膜痛--+-咽峽炎-+--發(fā)熱性疾病-+++出血性結(jié)膜炎.-+--呼吸系統(tǒng)感染++++不明原因發(fā)熱++++糖尿病/胰腺炎--+-第34頁，共39頁。人腸道病毒感染的臨床表現(xiàn)

脊髓灰質(zhì)炎柯薩奇病毒?？刹《?-34型新型腸道病毒臨床表現(xiàn)A組B組神經(jīng)系統(tǒng)：無菌性腦膜炎Ⅰ-Ⅲ型多個型別1-6多個型別71麻痹型Ⅰ-Ⅲ型4.7.92-52.4.6.9.11.3070.71腦炎

2.5-7.91-52.6.9.17.1971皮膚和粘膜：皰疹性咽峽炎

2-6.8.10

手足口病

5.9.10.16

71皮疹

多個型別1.3.52.4.6.9.11.16.18

心臟和肌肉：胸痛

91-51.6.9

心肌炎4.161-51.6.9.19

眼：急性出血性結(jié)膜炎

24

70呼吸系統(tǒng)：感冒

21.241-3.4.54.9.11.20.25

肺炎

4.5

68消化系統(tǒng)：腹瀉

18.20-22.24

18.20

肝炎4.954.972其他：發(fā)熱

1-6

新生兒全身感染Ⅰ-Ⅲ型1-53.4.6.9.17.19

糖尿病

3.4.5

第35頁，共39頁。引起的疾病麻痹性疾病

–脊灰病毒是最常見的引起麻痹性疾病的病原體，但其它病毒有時也可引起，如腸道病毒

71型（EV71）無菌性腦膜炎

–所有人腸道病毒都可以引起,尤其常見于5歲以下兒童；腦炎

–典型或者不典型的腦炎可能伴有腦膜炎癥狀．大部分病例恢復后不留后遺癥；“不明原因”發(fā)熱–

由A組柯薩奇病毒（CoxA16）和EV71引起，但B組柯薩奇病毒和某些埃可病毒也經(jīng)常造成暴發(fā)；咽峽炎

–由

A組柯薩奇病毒引起；傳染性胸膜痛(