地塞米松對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用wanghui王慧一、項(xiàng)目科學(xué)水平、意義本研究將糖皮質(zhì)激素地塞米松應(yīng)用于肝臟缺血再灌注損傷的防治，觀察其對(duì)肝臟缺血再灌注損傷早期Toll樣受體4（TLR4）蛋白表達(dá)的影響，探討TLR4信號(hào)通路在肝臟缺血再灌注損傷中的作用，以及地塞米松改善肝臟缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為臨床肝臟切除和肝臟移植中缺血再灌注損傷的預(yù)防打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

本項(xiàng)目為肝臟缺血再灌注損傷的防治探索新的方法，此種方法符合中國(guó)國(guó)情，將開(kāi)辟新的研究領(lǐng)域。地塞米松是人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素，由于其顯著的藥理作用和廉價(jià)易獲得的特性成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，故廣泛應(yīng)用于各科治療多種疾病，是臨床常用藥物。本課題立題科學(xué)、思路新穎，抓住了目前國(guó)際上肝臟缺血再灌注損傷研究的熱點(diǎn)。本研究將地塞米松應(yīng)用于肝臟缺血再灌注損傷的防治，并觀察對(duì)TLR4信號(hào)通路影響，為臨床肝切除和肝移植過(guò)程中的肝缺血再灌注損傷的防護(hù)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。二、本項(xiàng)目研究的立項(xiàng)依據(jù)即國(guó)內(nèi)外進(jìn)展（列出主要參考文獻(xiàn)）

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟和創(chuàng)傷外科疾病中常見(jiàn)的病理過(guò)程，對(duì)其機(jī)制及防治措施的研究具有重要的臨床意義。導(dǎo)致肝臟缺血再灌注損傷的原因眾多，確切機(jī)理目前仍不十分清楚。其發(fā)生的病理生理機(jī)制復(fù)雜，有諸多因素參與其中，形成相互制約和相互促進(jìn)的關(guān)系，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血小板聚集，氧自由基的產(chǎn)生和釋放、各種炎性介質(zhì)（如粘附分子和白三烯）和血管活性物質(zhì)（如一氧化氮和內(nèi)皮素等）的產(chǎn)生有關(guān)。Toll樣受體4和核因子NF-κB(Nuclearfactor-kappaB，NF-κB)很可能是肝臟缺血再灌注損傷早期出現(xiàn)的信號(hào)通路。Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)為新近發(fā)現(xiàn)的一種跨膜受體，在哺乳動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)11種(TLR1-TLR11)，分別識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式，在炎癥信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用。

肝臟缺血再灌注損傷預(yù)防的的方法大致可分為三種，即缺血預(yù)處理(IP)、藥物預(yù)處理和基因治療。IP即在缺血前行幾次短暫的缺血再灌注損傷過(guò)程，肝臟可以耐受更長(zhǎng)時(shí)間的缺血。然而肝臟IP的保護(hù)作用畢竟有限，Schulz等發(fā)現(xiàn)IP經(jīng)典保護(hù)作用能維持1-2h，在經(jīng)歷200min較長(zhǎng)時(shí)間缺血后IP作用消失。

藥物預(yù)處理是指利用某些活性物質(zhì)直接或間接的藥理作用來(lái)達(dá)到類似缺血預(yù)處理的保護(hù)作用，增強(qiáng)組織或細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，從而減輕損傷。針對(duì)缺血再灌注損傷的機(jī)制，目前研究已發(fā)現(xiàn)在肝臟具有預(yù)處理效果的藥物主要有鈣通道阻滯劑、自由基清除劑、改善微循環(huán)或細(xì)胞能量代謝的藥物、阿霉素、熊去氧膽酸鹽以及心房肽等。以上這些預(yù)處理的藥物雖然從各個(gè)不同的角度減輕肝臟缺血再灌注損傷，但其中許多藥物或有較大的毒副作用，或是作用環(huán)節(jié)單一，因而影響了它們?cè)谂R床的應(yīng)用。隨著對(duì)肝臟內(nèi)皮細(xì)胞在缺血再灌注損傷中作用的認(rèn)識(shí)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因治療和基因敲除技術(shù)被應(yīng)用于缺血再灌注損傷的防護(hù)。利用該技術(shù)，有效清除有害基因，可控制炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，限制排斥，抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化，減輕缺血再灌注損傷。但目前還限于實(shí)驗(yàn)研究，而且存在基因轉(zhuǎn)染率不高和原癌基因激活的可能等問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐均證實(shí)糖皮質(zhì)激素對(duì)肝缺血再灌注素?fù)p傷具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，家兔入肝血流阻斷前3O分鐘預(yù)用甲基強(qiáng)的松龍(MP)30mg／kg，可顯著提高家兔對(duì)肝缺血的耐受性，提高其生存率，減輕肝組織損害。甲基強(qiáng)的松龍與缺血預(yù)處理的作用一樣，能夠減輕正常大鼠缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)，降低線粒體氧化應(yīng)激酶、減少腸道菌群和細(xì)菌移位。嚴(yán)重肝外傷病人使用Pringles法阻斷肝血流控制肝臟大出血，為延長(zhǎng)肝臟耐受缺血時(shí)間，阻斷肝血流前，常規(guī)靜注甲基強(qiáng)的松龍30～40mg／kg，并同時(shí)降低肝表面溫度至27～32℃，可以取得滿意效果。

術(shù)前給予糖皮質(zhì)激素能夠減少肝臟缺血再灌注損傷，降低肝切除術(shù)后（與肝臟缺血再灌注損傷有關(guān)的）并發(fā)癥的發(fā)生。但是作用機(jī)制尚不清楚，也很少進(jìn)行深入的研究。本課題立題科學(xué)、思路新穎，抓住了目前國(guó)際上肝臟缺血再灌注損傷研究的熱點(diǎn)。本研究將地塞米松應(yīng)用于肝臟缺血再灌注損傷的防治，并觀察對(duì)TLR4信號(hào)通路影響，為臨床肝切除和肝移植過(guò)程中的肝缺血再灌注損傷的防護(hù)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。主要參考文獻(xiàn)1人參皂甙聯(lián)合地塞米松對(duì)肝總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠肝功能的保護(hù)作用。中華肝臟病雜志2007；15（10）：793-7942地塞米松在肝臟缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展。中華肝臟病雜志2010；18（11）：875-8773預(yù)處理對(duì)高原大鼠肝臟缺血再灌注損傷中防護(hù)作用。高原醫(yī)學(xué)雜志2002；12（3）：8-114.活血化瘀注射液l號(hào)預(yù)處理與缺血預(yù)處理改善肝缺血再灌注損傷.世界華人消化雜志,2007;15(8):831-8375.HHI-I對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2007;13(4):386-3926.肝臟缺血再灌注損傷防治的研究進(jìn)展.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2007;10(20):1473-147三、本項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)和擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題

研究?jī)?nèi)容：（1）建立穩(wěn)定的肝臟缺血再灌注損傷模型，觀察地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)肝臟組織學(xué)改變的影響（2）地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)門靜脈血內(nèi)毒素和血漿TNF-α、IL-1β（3）地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)TLR4蛋白和mRNA表達(dá)的影響研究目標(biāo)：

本研究將糖皮質(zhì)激素地塞米松應(yīng)用于肝臟缺血再灌注損傷的防治，觀察其對(duì)肝臟缺血再灌注損傷早期Toll樣受體4（TLR4）蛋白表達(dá)的影響，探討TLR4信號(hào)通路在肝臟缺血再灌注損傷中的作用，以及地塞米松改善肝臟缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為臨床肝臟切除和肝臟移植中缺血再灌注損傷的預(yù)防打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。解決的關(guān)鍵問(wèn)題：采用分子生物學(xué)方法和免疫組化檢測(cè)大鼠肝缺血再灌注損傷中Toll樣受體4表達(dá)！實(shí)驗(yàn)方法和步驟制作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物模型分4組假手術(shù)組缺血再灌注組地塞米松組丹參組檢測(cè)門靜脈內(nèi)毒素血漿腫瘤壞死因子TNF-α白介素IL-1βTLR-4和mRNA四、本項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)與特色將糖皮質(zhì)激素地塞米松應(yīng)用于肝臟缺血再灌注損傷，并研究其對(duì)Toll樣受體4信號(hào)通路的影響。五、研究工作的總體安排及進(jìn)度2012年3月～2012年4月：建立穩(wěn)定的肝臟缺血再灌注損傷模型，觀察地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)肝臟組織學(xué)改變的影響2012年5月～2012年6月：地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)門靜脈血內(nèi)毒素和血漿TNF-α、IL-1β2012年7月～2012年9月：地塞米松對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)的影響2012年12月～2013年2月：總結(jié)材料，撰寫論文，申報(bào)科研成果.六、研究工作的預(yù)期成果、應(yīng)用前景預(yù)期成果糖皮質(zhì)激素地塞米松I對(duì)肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，地塞米松的作用機(jī)制可能是下調(diào)Toll樣受體4蛋白和mRNA的表達(dá)，降低血漿TNF-α、IL-1β和門靜脈內(nèi)毒素水平，抑制肝細(xì)胞凋亡，減輕肝組織的病理?yè)p害。預(yù)期發(fā)表國(guó)家級(jí)或省級(jí)論文2～3篇，申報(bào)省級(jí)或者國(guó)家級(jí)科研課題打下基礎(chǔ)，培養(yǎng)具有科研初步能力和思維的大學(xué)生2-3名。預(yù)期應(yīng)用前景在經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)，將糖皮質(zhì)激素地塞米松應(yīng)用于臨床肝臟切除和肝臟移植中肝缺血再灌注損傷的防護(hù)，減少術(shù)中出血量及術(shù)后肝功能障礙和其它并發(fā)癥的發(fā)生，促進(jìn)肝切除和肝臟移植患者盡快的康復(fù)，縮短住院時(shí)間，降低醫(yī)療費(fèi)用，因此具有廣闊的應(yīng)用前景，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。還可以作為臨床肝移植提高供肝耐受缺血、延長(zhǎng)供肝保存時(shí)間的一個(gè)方法。

七、申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)預(yù)算內(nèi)容金額數(shù)（元）備