第10頁共10頁構(gòu)建仿生牙周有序雙層納米結(jié)構(gòu)的支架材料天然牙周組織具由復(fù)雜的礦化與非礦化的有序結(jié)構(gòu)組成，構(gòu)建一個(gè)完整的、生理功能性的牙周復(fù)合結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。本研究從仿生角度出發(fā)，構(gòu)建仿生牙周有序雙層納米結(jié)構(gòu)的支架材料，從微納結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能、因子微環(huán)境等多方面模擬了天然牙周組織，可募集并調(diào)控自體干細(xì)胞多向分化，最終實(shí)現(xiàn)牙周軟硬組織協(xié)同再生。

01、研究內(nèi)容簡介

牙周病患病率高，常導(dǎo)致牙周支持組織缺損，是導(dǎo)致牙齒喪失、危害全身健康的主要口腔疾病之一。天然牙周組織是由軟、硬組織共同構(gòu)成的一個(gè)功能系統(tǒng)，軟組織包括牙周膜和牙齦，硬組織包括牙槽骨和牙骨質(zhì)。由于牙周組織具有復(fù)雜的礦化與非礦化多層有序結(jié)構(gòu)，因此很難重建天然牙周組織結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)牙周組織功能性再生。

生物可降解支架與生長因子相結(jié)合的新型組織工程技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。生物可降解支架提供生理微環(huán)境并傳遞生長因子，有助于調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的遷移、增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，為牙周組織再生提供了一種有前景的治療方法。目前，很多搭載生物因子的支架材料被開發(fā)，如共組裝基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的超分子水凝膠可同時(shí)持續(xù)釋放兩種生物活性因子，從而有效促進(jìn)牙周骨組織的重建。然而，以往多數(shù)研究僅制備了單相支架，難以再生出復(fù)雜的牙周多層組織結(jié)構(gòu)。

具有明顯不同的物理性能和化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙相或多相支架已用于牙周組織再生?；谝龑?dǎo)性組織再生的原理，有學(xué)者制備出模擬軟硬組織界面的多相支架，包括半剛性聚乳酸-共乙醇酸和磷酸鈣雙分子層生物材料、聚己內(nèi)酯-聚乙醇酸雙分子層生物混合材料、幾丁質(zhì)-聚乳酸-共乙醇酸/納米生物活性玻璃陶瓷/牙骨質(zhì)蛋白三相水凝膠支架材料。盡管先前報(bào)道模擬牙周組織差異結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性的多相支架能夠在一定程度上形成牙周樣結(jié)構(gòu)，但完整的牙周組織功能性再生仍具挑戰(zhàn)性。另外，模擬牙周組織的分級(jí)微/納米結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生長因子微環(huán)境的報(bào)道較少，干細(xì)胞多向分化形成軟硬組織的機(jī)制仍存在爭議。

牙周組織再生必須滿足以下三個(gè)條件：（1）構(gòu)建具有不同力學(xué)性能的礦化與非礦化雙相支架;（2）構(gòu)建分級(jí)的微/納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以模擬天然牙周組織結(jié)構(gòu);（3）提供生物活性因子以募集宿主干細(xì)胞，并調(diào)控其多向分化。

在本研究中，我們利用納米蝕刻模板將新一代血小板濃縮生長因子（CGF）制成仿牙周膜樣平行結(jié)構(gòu)，通過自組裝技術(shù)構(gòu)建仿牙槽骨樣多孔結(jié)構(gòu)的纖維內(nèi)礦化膠原（IMC）支架，最后采用微壓印技術(shù)將CGF與IMC機(jī)械結(jié)合制成仿牙周有序雙層CGF/IMC納米支架材料，并表征了雙層材料的微納結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、生長因子的釋放和對(duì)成纖維向和成骨向分化的調(diào)控作用及機(jī)制。仿生有序雙層支架的CGF層表現(xiàn)為平行有序纖維結(jié)構(gòu)，其楊氏模量為42.62±4.58MPa，接近天然牙周膜，可誘導(dǎo)干細(xì)胞平行排列和成纖維向分化;IMC層呈現(xiàn)骨樣橫紋結(jié)構(gòu)和納米均勻多孔微觀結(jié)構(gòu)，其楊氏模量為1409.00±160.83MPa，接近天然牙槽骨，可誘導(dǎo)干細(xì)胞交錯(cuò)排列和成骨向分化。材料CGF層和界面均高表達(dá)生長因子TGF-β1和VEGF，并持續(xù)緩釋至14天。CGF/IMC支架表面的干細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1和p-Smad3（Fig.1和Fig.2）。

圖1.礦化/非礦化雙層結(jié)構(gòu)的制造和表征。a）用于制造分層CGF/IMC雙相支架的示意圖。b）CGF層和IMC層的SEM和LSM圖像在自上而下的視圖中。c）側(cè)視圖中分層CGF/IMC雙層界面的SEM和LSM圖像。黃色開口箭頭和白點(diǎn)線表示CGF/IMC的界面（約150μm）。d）TEM和AFM納米結(jié)構(gòu)，以及CGF層和IMC層的楊氏模量。CGF原纖維是平行排列的，IMC具有典型的D周期（?67nm，在兩個(gè)黃色開放箭頭之間）。所選區(qū)域電子衍射表明，IMC中的納米羥基霰石表現(xiàn)出完美的晶體結(jié)構(gòu)，c軸優(yōu)先沿膠原軸定向（插圖）。：P<0.001.

圖2.體外多級(jí)CGF/IMC雙層結(jié)構(gòu)的生長因子豐富的微環(huán)境和細(xì)胞調(diào)控。a）TGF-β1和VEGF在CGF層和CGF/IMC雙分子層的橫截面中的免疫熒光染色。b）從CGF/IMC雙層體外累積釋放TGF-β1和VEGF1，持續(xù)14天。c）CCK-8測(cè)定。d）平行排列的CGF（P-CGF），隨機(jī)排列的CGF（R-CGF）和IMC層中的細(xì)胞排列在1天。e）在7天培養(yǎng)的P-CGF和R-CGF培養(yǎng)的PDLSCs中纖維分化相關(guān)基因（Postn和彈性蛋白）的mRNA表達(dá)水平，以及在6孔板（對(duì)照）和P-CGF上培養(yǎng)的14天培養(yǎng)的PDLSCs中的成骨分化相關(guān)基因（Runx2和OPN）的mRNA表達(dá)水平。f）7天在P-CGF和R-CGF中對(duì)POSTN進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。g）14天在6孔板和IMC上培養(yǎng)的PDLSCs中成骨分化相關(guān)基因（Runx2和OPN）的mRNA表達(dá)水平，以及在6孔板和IMC上培養(yǎng)的PDLSCs中成纖維分化相關(guān)基因（Postn和彈性蛋白）的mRNA表達(dá)水平。h）在6孔板和IMC培養(yǎng)的PDLSC中SP7和ALP的免疫印跡，在7天時(shí)進(jìn)行。i，j）在6孔板和CGF/IMC培養(yǎng)的PDLSC中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白質(zhì)印跡3天。*：P<0.05;**：P<0.01;：P<0.001.

將該仿生支架材料植入大鼠牙周缺損區(qū)8周后，CGF/IMC組新生骨密度與天然骨密度一致，可見連續(xù)完整的新生牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，新生牙周膜膠原纖維較成熟，并有豐富的血管新生;而陽性對(duì)照組（BIO-OSS骨粉與CGF直接混合）缺損區(qū)多為未降解材料，可見少量新生牙槽骨和周牙膜;Blank組（無材料植入）缺損區(qū)未見新生牙周組織。牙槽骨標(biāo)記物BMP2、OCN，牙周膜標(biāo)記物COL-1，血管標(biāo)記物VEGFR-1，干細(xì)胞標(biāo)記物CD90和CD105，TGF-β1和Smad3在CGF/IMC組的表達(dá)量均明顯高于其他組（Fig.3，F(xiàn)ig.4和Fig.5）。

圖3.CGF/IMC雙層架構(gòu)的原位多譜系分化。a）將CGF/IMC雙層移植到大鼠牙周組織缺損中的方案。b）牙周缺損和CGF/IMC雙層植入的手術(shù)圖像。c）Micro-CT，HE和Mason的三色染色在4周時(shí)對(duì)牙周缺損修復(fù)的橫截面進(jìn)行染色。白線表示顯微CT圖像中的缺陷邊界。D：牙本質(zhì)，PDL：牙周韌帶，AB：肺泡骨，S：支架，BM：骨髓，V：血管。d）在顯微CT和HE圖像中對(duì)新形成的肺泡骨，骨水泥和牙周韌帶百分比進(jìn)行半定量分析。*：P<0.05對(duì)空白，#：P<0.05對(duì)CGF，&：P<0.05對(duì)CGF–DBBM。

圖4.在體內(nèi)完全恢復(fù)牙周組織。a）微CT，HE和Mason的牙周組織再生區(qū)域的三色染色。白線顯示缺陷邊界。D：牙本質(zhì)，PDL：牙周韌帶，AB：肺泡骨，S：支架，V：血管，指針：骨水泥。b）在顯微CT和HE圖像中對(duì)新形成的肺泡骨，骨水泥和牙周韌帶百分比進(jìn)行半定量分析。*：P<0.05vsBlank，#：P<0.05vsCGF，&：P<0.05vsCGF–DBBM，△：P<0.05vs.Naturalperiodontium。

圖5.通過宿主干細(xì)胞募集和Smad3活化，通過CGF/IMC雙層結(jié)構(gòu)促進(jìn)牙周組織再生。a）TGF-β1和CD105以及TGF-β1和CD90植入4周后的免疫熒光共染色。b）每片（a）的陽性細(xì)胞數(shù)的半定量分析。c）植入8周后，在新形成的肺泡骨（AB）區(qū)域和牙周韌帶（PDL）區(qū)域?qū)MP2，OCN，COL-1，VEGFR-1，TGF-β1和Smad3進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。d）每片（c）的陽性細(xì)胞數(shù)的半定量分析。*：P<0.05對(duì)空白，#：P<0.05對(duì)CGF，&：P<0.05對(duì)CGF–DBBM。

將該仿生支架材料植入裸鼠皮下8周后，CGF/IMC可形成牙周膜和牙槽骨樣結(jié)構(gòu)，BMP2、COL-1、VEGFR-1及干細(xì)胞標(biāo)記物CD146和STRO-1高表達(dá)（Fig.6）。

圖6.異位再生模型中CGF/IMC雙層結(jié)構(gòu)的宿主MSC募集和多譜系分化。a）新組織的代表性顯微CT圖像和HE染色圖像。注意：新骨，S：支架，V：血管。b）代表Masson的三色染色和新組織的SEM圖像。i）骨樣組織區(qū)域;ii）PDL樣組織區(qū)域。F：纖維;黃色箭頭：具有延伸的假足的細(xì)胞。c）CD146、STRO-1、BMP2、COL-1