2015生物工程導論考試題論述題（每題25分，共計100分）PCR技術的基本原理。PCR因是什么？如何解決。⑴PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA下,DNA聚合酶的酶促合成反應。DNADNA為模板,借助一DNA來啟動合成,DNA模板中的一段互補序列結合,形成部分雙鏈.在適宜的溫度和環(huán)境下,DNA聚合酶將3′-OH末端,并以此為起始點,5′→3′方向延伸,合成DNA互補鏈.PCR反應過程中出現(xiàn)多條帶或沒有目的帶出現(xiàn)的原因如下：①引物設計的不夠好,導致擴增效率低；②火溫度過低③DNA模板濃度過低，會導致條帶暗；濃度過高，PCR反應會受到抑制,擴增效率不高；提取的DNA純度不高,導致擴增效率降低。④DNA聚合酶活性不夠高解決方法①做溫度梯度PCR摸索下最佳退火溫度，減少引物與模板之間非特異性的結合。TmTm值過高,Tm太大,或者引物單鏈易形成高級結構,PCR反應..③檢查一下模板純度，對模板進行純化。模板越純,條帶越特異.反之模板雜亂，就容易引起非特異性條帶。④更換高保真和高活性的聚合酶，從而更容易得到特異性條帶。DNA基因表達的方法有哪些？DNA分子導入細胞的常用方法有：①轉(zhuǎn)化法。制備感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化。其缺點是轉(zhuǎn)化效率低。DNA法。其缺點是導入時需考慮安全因素。③物理轉(zhuǎn)化法包括基因槍法，其優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高、受體廣泛、操作簡單。電激法。轉(zhuǎn)化效率高，但是容易造成不可逆擊穿，處理細胞成活率低微注射法。其有優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高，缺點是需要對細胞進行固定后，才能進行定位顯微注射操作激光微束法。其優(yōu)勢是激光微束引起細胞膜穿孔是可逆性的。體的存活。④化學方法PEG法。其特點是材料易得,用法簡單,融合效果穩(wěn)定。脂質(zhì)體法。其特點是轉(zhuǎn)染效率高，但是對細胞毒性較大。提高外源基因的表達方法有①提高啟動子強度②縮短啟動子同克隆基因間距離③高效的翻譯起始序列④高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)⑤提高質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性⑥蛋白的融合表達大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均為原核生物優(yōu)點：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調(diào)控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現(xiàn)多種基因的高效表達。表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、細胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達等。④易培養(yǎng)，成本低。缺點：①大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難②因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達產(chǎn)物需經(jīng)變性復性才恢復活性③蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基④其內(nèi)毒素很難除去。優(yōu)點：①非致病性：基本對人畜無害。②轉(zhuǎn)化外源DNA的感受態(tài)系統(tǒng)也同樣適用于轉(zhuǎn)化重組DNA。③質(zhì)粒和噬菌體都可以作為克隆的載體?；祀s內(nèi)毒素。中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單。⑥良好的發(fā)酵基礎和生產(chǎn)技術，在相對簡單的培養(yǎng)基中能生長到很高的密度。⑦沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產(chǎn)物也不容易形成包涵體。缺點如下：①能夠產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達產(chǎn)物的大量降解。②能自發(fā)形成感受的的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低。③存在限制和修飾系統(tǒng)，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定。試述動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求和動物細胞培養(yǎng)的基本過程。動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求動物細胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)包括無機物（無機鹽、微量元素等），有機物（糖、氨基酸、促生長因子等）。培養(yǎng)過程中，還需要加入血清和血漿。動物細胞培養(yǎng)的基本過程取動物組織塊——剪碎組織——用胰蛋白酶處理分散成單個細胞——制成