第十一章熒光分析法

Fluoreometry第十一章熒光分析法熒光11/22/20223:54:36AM/bbs熒光的產(chǎn)生發(fā)射與激發(fā)光譜熒光儀器定量關(guān)系熒光效率熒光9/24/202212:51:54PMhttp://概述用熒光來(lái)進(jìn)行定性定量的分析方法——熒光分析法。光照分子基態(tài)激發(fā)態(tài)輻射躍遷熒光可見-紫外光源分子熒光分析

由熒光波長(zhǎng)可確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)由熒光強(qiáng)度可測(cè)物質(zhì)的含量

概述用熒光來(lái)進(jìn)行定性定量的分析方法——熒光分析法。

§1熒光分析法基本原理

一、分子熒光（一）、分子熒光的產(chǎn)生分子在輻射能的照射下，電子躍遷至單重激發(fā)態(tài)，并以無(wú)輻射弛豫方式回到第一單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，由此再躍回基態(tài)或基態(tài)中其它振動(dòng)能級(jí)時(shí)所發(fā)出的光。

基態(tài)和激發(fā)態(tài)單重態(tài)和三重態(tài)輻射躍遷（光）和無(wú)輻射躍遷（熱）

激發(fā)單重態(tài)：用S表示，↑↓受激電子的自旋方向不變，與基態(tài)電子自旋方向相反。激發(fā)三重態(tài)：用T表示，↑↑受激電子自旋反轉(zhuǎn)，與基態(tài)電子自旋方向平行。概念單重基態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)基態(tài)和激發(fā)態(tài)激發(fā)單重態(tài)：用S表示，↑↓概念單單線態(tài)與三線態(tài)

Mg的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)3s3p單線態(tài)S0單線態(tài)S1三線態(tài)T1

S1→S0熒光輻射T1→S0磷光輻射禁阻躍遷，改變自旋后S1T1S0S0單線態(tài)與三線態(tài)Mg的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)3s3p單線態(tài)S0激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：

1.能量高2.激發(fā)單重態(tài)平均壽命短，tS=10-8s,3.基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷1.能量低2.激發(fā)三重態(tài)平均壽命長(zhǎng)，tS=10-4--1s,3.基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷激發(fā)單重態(tài)S激發(fā)三重態(tài)T激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：

去活化過程輻射躍遷無(wú)輻射躍遷振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換體系間跨越猝滅熒光磷光去活化過程輻射躍遷無(wú)輻射躍遷振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換體系間跨越猝滅熒光熒光形成機(jī)制單重態(tài)第二激發(fā)態(tài)第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換體系跨越振動(dòng)弛豫基態(tài)振動(dòng)弛豫熒光形成機(jī)制單重態(tài)第二激發(fā)態(tài)第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)熒光磷熒光產(chǎn)生過程熒光的產(chǎn)生eeee熒光產(chǎn)生過程熒光的產(chǎn)生eeee熒光磷光處于第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子發(fā)射光量子回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這一過程為熒光發(fā)射處于第一電子激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子發(fā)射光量子回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這一過程為磷光發(fā)射。不同點(diǎn)起源不同波長(zhǎng)不同壽命不同熒光磷光處于第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子發(fā)射光量子回吸收峰磷光峰熒光峰吸收峰磷光峰熒光峰激發(fā)光源單色器Ⅰ樣品池ItF單色器Ⅱ檢測(cè)器發(fā)射記錄I0透過光(二)、熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜熒光的檢測(cè)

熒光光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)，改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)熒光強(qiáng)度和激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系。固定激發(fā)波長(zhǎng)，（為最大激發(fā)波長(zhǎng)），測(cè)不同波長(zhǎng)時(shí)的熒光強(qiáng)度。熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜熒光光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)，改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)熒光強(qiáng)度和激發(fā)光波長(zhǎng)的200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)第十一章熒光分析法課件熒光光譜特征Stokes位移：熒光波長(zhǎng)一般比激發(fā)波長(zhǎng)要長(zhǎng)(前者能量較低)熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；熒光光譜與激發(fā)光譜形狀相似，呈鏡像對(duì)稱。熒光光譜特征Stokes位移：熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；熒鏡像對(duì)稱規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（激發(fā)光譜）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。熒光光譜特征鏡像對(duì)稱規(guī)則熒光光譜特征

熒光產(chǎn)生的必要條件有吸收結(jié)構(gòu)有高的熒光效率二、熒光與分子結(jié)構(gòu)熒光產(chǎn)生的必要條件有吸收結(jié)構(gòu)有高的熒光效率二、熒光與（一）、熒光效率（fluorescenceefficiency）

（一）、熒光效率（fluorescenceefficie分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基類型共軛高熒光效率高剛性平面使熒光效率高1、給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸電子基團(tuán)使熒光減弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基團(tuán)對(duì)熒光影響不明顯。分子結(jié)構(gòu)與熒光長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基類型共軛高熒光效率高第十一章熒光分析法課件第十一章熒光分析法課件第十一章熒光分析法課件三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

A、溫度影響溫度上升，熒光減弱B、溶劑的影響增大溶劑的極性使熒光增強(qiáng)含重原子的溶劑（e.g.CBr4）使熒光減弱溶劑粘度降低熒光強(qiáng)度減弱

C、酸度的影響

D、熒光熄滅劑激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用，使能量轉(zhuǎn)移，熒光強(qiáng)度減弱甚至消失。E、散射光三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素A、溫度影響第十一章熒光分析法課件散射光干擾及消除散射光：當(dāng)一束平行光投射在液體試樣上，大部分被吸收或透過，小部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向改變，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：無(wú)能量的交換，λ散射≈λ激發(fā)拉曼光：有能量轉(zhuǎn)移，λ散射><λ激發(fā)散射光干擾及消除散射光：當(dāng)一束平行光投射在液體試樣上，大部分第十一章熒光分析法課件干擾的消除1）改變激發(fā)光的波長(zhǎng)；2）更換溶劑；CCL4的拉曼光與激發(fā)光波長(zhǎng)相近，其拉曼光幾乎不干擾熒光測(cè)定。干擾的消除§2熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系

I0I

F①

在ECl≤0.05時(shí)，F(xiàn)=KC,溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系；②在ECl＞0.05，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度不呈線性關(guān)系；③熒光分析法的測(cè)定靈敏度高。§2熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系泰勒級(jí)數(shù)展開即吸收的強(qiáng)度入射的出射的A=kbc定量關(guān)系泰勒級(jí)數(shù)展開即吸收的強(qiáng)度入射的出射的A=kbc定量關(guān)系通常A<0.05If與A

的關(guān)系A(chǔ)與c正比，低濃度泰勒級(jí)數(shù)展開，僅取一項(xiàng)，x越小越符合定量關(guān)系通常A<0.05If與A的關(guān)系泰勒級(jí)數(shù)展開，僅取一項(xiàng)，定二、定量分析法⒈校正曲線法⒉比例法

二、定量分析法⒈校正曲線法

F=K（I0-I）=K’（I0-I）=K’（1-10ECL）=K’（1-e2.3ECL）=2.3K’I0ECL=KC

ECL<0.05當(dāng)濃度較濃時(shí)，吸光度ECL>0.05時(shí)，熒光強(qiáng)度同濃度的線性關(guān)系將向濃度軸偏離。熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系F=K（I0-I）=K’（I0-I）熒光強(qiáng)度與物分光法與熒光法定量比較

UV-VIS分光法

熒光法定量基礎(chǔ)A=lgI0/IFC靈敏度 與有關(guān)與有關(guān)檢測(cè)限 10-6-10-9 10-9-10-12

靈敏度高選擇性好分光法與熒光法定量比較光源單色器1樣品池單色器2檢測(cè)器放大與記錄垂直方向§3

熒光光度計(jì)

光源單色器1樣品池單色器2檢測(cè)器放大垂直方向§3熒光光度

與分光光度計(jì)的主要差別①

垂直測(cè)量方式,消除透射光影響②兩個(gè)單色器，激發(fā)和發(fā)射，常用光柵熒光儀特點(diǎn)與分光光度計(jì)的主要差別①垂直測(cè)量方式,消除透射光影響②

1光源A、白熾燈：鎢燈、鹵鎢燈B、氣體放電燈：氫、氙、汞， 常用氙燈（波長(zhǎng)：250-700nm）C、激光光源

2單色器閃耀光柵

3檢測(cè)器光電倍增管1光源§4分子熒光分析法的在藥學(xué)中的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)陽(yáng)離子發(fā)生熒光的很少，但很多能與一些有機(jī)試劑形成熒光絡(luò)合物而被測(cè)定；2.一些陰離子能使熒光減弱，可利用熒光猝滅法測(cè)定；3.脂肪族有機(jī)物分子能發(fā)生熒光的也不多，可與某些有機(jī)試劑反應(yīng)后生成會(huì)發(fā)射熒光的衍生物加以測(cè)定；§4分子熒光分析法的在藥學(xué)中的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)陽(yáng)離子發(fā)生熒光的4.芳香族化合物因有共軛結(jié)構(gòu)，多數(shù)能發(fā)射熒光；5.弱熒光的芳香族化合物也可與熒光試劑作用生成強(qiáng)熒光衍生物以提高測(cè)量靈敏度。故藥物中的胺類、抗菌素、維生素、甾體類均可用熒光法測(cè)定。該法在體內(nèi)藥物定量分析中應(yīng)用甚廣。4.芳香族化合物因有共軛結(jié)構(gòu)，多數(shù)能發(fā)射熒光；1.熒光和磷光在產(chǎn)生機(jī)制上有什么不同？2.何謂熒光量子效率？哪些結(jié)構(gòu)物質(zhì)有較高熒光效率？3.以下物質(zhì)中可能有最強(qiáng)熒光的物質(zhì)是（）。思考題1.熒光和磷光在產(chǎn)生機(jī)制上有什么不同？思考題4.熒光光譜分析中的最主要光譜干擾是().A.激發(fā)光;B.磷光;C.拉曼光;D.容器表面產(chǎn)生的散射光5．測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí),要在與入射光成直角的方向測(cè)量,這是因?yàn)?).A.只有在與入射光成直角的方向上才有熒光;B.在成直角方向測(cè)量可以避免散射光的影響;C.在成直角方向測(cè)量可免除透射光的影響;D.熒光的強(qiáng)度比入射光強(qiáng)6.（）熒光光譜形狀與激發(fā)光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。7.熒光光譜的特征？4.熒光光譜分析中的最主要光譜干擾是().1.所謂熒光，即指某些物質(zhì)經(jīng)入射光照射后，吸收了入射光的能量，從而輻射出比入射光()。A.波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線B.波長(zhǎng)短的光線C.能量大的光線D.頻率高的光線2.下列說(shuō)法正確的是()A熒光發(fā)射波長(zhǎng)永遠(yuǎn)大于激發(fā)波長(zhǎng)B熒光發(fā)射波長(zhǎng)永遠(yuǎn)小于激發(fā)波長(zhǎng)C熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)D熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)3．熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系的條件是()A.單色光B.ECl≤0.05C.入射光強(qiáng)度I0一定D.樣品池厚度一定1.所謂熒光，即