人血清白蛋白的酵母重組表達研究進展2011.04.012011-04-011人血清白蛋白的酵母重組表達研究進展2011-04-011人血清白蛋白供需不平衡監(jiān)管嚴格采血站數(shù)量下降血液傳染病病毒泛濫不再審批新的生產(chǎn)企業(yè)進口受到嚴格限制需求量巨大2011年02月12日有文章稱《血液制品“告荒”》國內(nèi)血液制品的嚴重短缺。這類產(chǎn)品，除了人血白蛋白，其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、靜脈丙種球蛋白等都處于嚴重短缺的狀態(tài)。來源網(wǎng)址：鳳凰網(wǎng)財經(jīng)頻道/roll/20110212/3389405.shtml2011-04-012人血清白蛋白供需不平衡監(jiān)管嚴格2011-04-012主要內(nèi)容國內(nèi)外進展酵母表達體系的建立rHSA在畢赤酵母的表達影響酵母表達外源蛋白的因素提高rHSA表達的一些策略rHSA在漢遜酵母中的表達與純化新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和純化rHSA結(jié)構(gòu)分析rHSA的應用展望2011-04-013主要內(nèi)容國內(nèi)外進展2011-04-013國內(nèi)外研究進展LawnR.M.等在1981年首次報道了重組人血白蛋白(RecombinantHumanSerumAlbumin,rHSA)cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)啟動子，色氨酸引導肽及來自質(zhì)粒pBR322的Tcr和Ampr基因構(gòu)建了第一個表達重組人血白蛋自的表達載體pHSAI并在大腸桿菌(E.coli)中得到了成功表達。HSA在大腸桿菌中表達量為細胞總蛋白的7%，但由于HSA含有大量的二硫鍵使得其在體外極難完成正確折疊，未能得到有生物功能的蛋白;同時細菌細胞壁脂多糖造成熱反應也帶來很多麻煩。2011-04-014國內(nèi)外研究進展2011-04-014國外研究進展國外許多實驗室和公司在重組白蛋白方面進行了大量研究，如英國的DELTA公司，美國的GENETECH公司以及日本的三菱公司等。日本在重組人血白蛋白方面的研究走在了最前面。1994年日本的綠十字GREENCROSS（三菱公司的前身)公司被批準進人二期臨床，現(xiàn)在日本三菱公司已完成三期臨床。該公司已經(jīng)建廠進行大規(guī)模生產(chǎn)，一期工程完畢可達12.5噸/年的生產(chǎn)能力，并計劃逐步提高到40噸/年，已預定商品名“Albrec”,所生產(chǎn)的產(chǎn)品純度可達99.999999%,英DELTA公司已經(jīng)完成一期臨床試驗，美國等正處于臨床前研究階段。2011-04-015國外研究進展國外許多實驗室和公司在重組白蛋白方面進行了大量研國內(nèi)研究進展近幾年來，我國也掀起了重組HSA的研究熱潮，華北制藥集團、中科院上海生化所、華東理工大學、中山醫(yī)科大學、中科院微生物所、過程工程研究所，以及安徽中科大亞杰科技股份有限公司等單位己經(jīng)開始利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)白蛋白的研究;目前我國在這方面的研究工作已經(jīng)取得一定進展。華東理工大學郭美錦，儲炬等于2000年發(fā)表文章稱該校生物反應器工程國家重點實驗室已經(jīng)采用Pichiapastoris進行了高密度高表達發(fā)酵研究,表達水平已達到5克/升左右。2011-04-016國內(nèi)研究進展近幾年來，我國也掀起了重組HSA的研究熱潮，華北來源網(wǎng)址：/redirect.php?tid=3180088&goto=lastpost

華北制藥：藥用基因工程重組人血白蛋白研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化項目華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司從1997年開始采用畢赤酵母作為宿主菌分泌表達重組人血白蛋（rHSA）。經(jīng)過多年的努力，通過與國內(nèi)外有關(guān)單位協(xié)作，已建立了從菌種構(gòu)建至發(fā)酵、純化的完整工藝。已得到穩(wěn)定高效表達人血白蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株完成了中試研究，開發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的純化工藝路線。制定了重組人血白蛋白的質(zhì)量標準草案，中試規(guī)模制備的樣品各項指標檢定合格。本項目內(nèi)容為按照現(xiàn)行CMP要求開發(fā)規(guī)模生產(chǎn)藝．建設藥用重組白蛋白生產(chǎn)基地，年生產(chǎn)規(guī)模達到噸級。市場分析，白蛋白總銷售量為120-150噸左右。2011-04-017來源網(wǎng)址：/redir來源網(wǎng)址：/Article/430719/1外界傳聞：華北制藥：馬上要公告獲得人造白蛋白。

事實上有消息源確認重組人血白蛋白馬上投產(chǎn)就等批文

可以理解為一旦批文下發(fā)，馬上投產(chǎn)

市場價人造白蛋白10克500塊

公司設計產(chǎn)能15噸

15噸產(chǎn)能，預計

2010

年底建成，2011

年初投產(chǎn)

新聞：

2011中國人血白蛋白制品360°產(chǎn)業(yè)論壇

時間：

2011-3-18

至

2011-3-19

地點：上海和頤酒店

主辦單位：

世易傳媒

2011-04-018來源網(wǎng)址：來源網(wǎng)址：/Article/430719/1基因重組人血白蛋白與華北制藥

王平華北制藥股份有限公司董事長

關(guān)于產(chǎn)品簡介：重組人血白蛋白未來將成為重磅產(chǎn)品

同人血白蛋白相比，重組人血白蛋白不僅純度更高，而且可以有效地避免人血白蛋白攜帶病毒的風險，另外還可以解決血源供應的周期性等問題。因此，重組人血白蛋白實現(xiàn)大規(guī)模量產(chǎn)在血液制品行業(yè)將具有革命意義。

受益于國內(nèi)血制品行業(yè)的高景氣度，該產(chǎn)品的市場潛力巨大。人血白蛋白市場供應缺口較大，并且這種局面不會在短時間改善?；蛑亟M人血白蛋白是人血白蛋白的替代產(chǎn)品。至今，在國際上掌握重組白蛋白的廠商也只有三家，日本綠十字、英國

Delta

公司和美國的默克。國內(nèi)除華北制藥外尚無單位能規(guī)?；a(chǎn)重組白蛋白項目。華北制藥除培養(yǎng)基級白蛋白外還掌握了更高級別的白蛋白技術(shù)，白蛋白產(chǎn)品純化技術(shù)已經(jīng)達到國際上先進水平。2011-04-019來源網(wǎng)址：rHSA表達體系的建立隨著基因重組技術(shù)所表達蛋白的復雜性越來越高，酵母作為真核生物具有能對所表達的蛋白進行翻譯后修飾，易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點逐漸取代大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白。在HSA的重組研究過程中，人們分別采用了釀酒酵母、漢遜醉母、裂殖酵母、克魯維氏酵母、畢赤酵母等作為宿主細胞，以及轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物來分泌表達重組人血白蛋白。2011-04-0110rHSA表達體系的建立隨著基因重組技術(shù)所表達蛋白的復雜性越人重組白蛋白不同表達體系的對比技術(shù)可行性表達量提取、純化安全性活性細菌可行毫克級難度高，后修飾困難-低酵母可行克級。國外有報道，達到5g/L,7g/L難度小。外分泌，可完成信號肽切除高高動物技術(shù)不成熟，實驗室階段高容易安全高植物可行，在馬鈴薯有成功表達，不成熟----2011-04-0111人重組白蛋白不同表達體系的對比技術(shù)可行性表達量提取、純化安全酵母表達體系的建立畢赤酵母由于分泌蛋白量高、表達穩(wěn)定，且70年代人們曾廣泛使用畢赤酵母生產(chǎn)單細胞蛋白，已基本掌握其生長規(guī)律及大規(guī)模高密度發(fā)酵技術(shù)，采用甲醇誘導強啟動子AOX，起始轉(zhuǎn)錄人血白蛋白，將表達質(zhì)粒整合到Pichiapastoris的基因組染色體上，表達質(zhì)粒不會因酵母傳代而丟失，可穩(wěn)定表達目的產(chǎn)物，且表達量高，用甲醇誘導時，表達率可占分泌總蛋白的80%以上。這非常有利于產(chǎn)物的提取。2011-04-0112酵母表達體系的建立畢赤酵母由于分泌蛋白量高、表達穩(wěn)定，且70酵母細胞表達系統(tǒng)中常用載體2011-04-0113酵母細胞表達系統(tǒng)中常用載體2011-04-0113不同酵母表達體系比較釀酒酵母畢赤酵母漢遜酵母2011-04-0114不同酵母表達體系比較釀酒酵母2011-04-0114rHSA常用表達系統(tǒng)中的比較-12011-04-0115rHSA常用表達系統(tǒng)中的比較-12011-04-0115rHSA在不同表達系統(tǒng)中的比較-22011-04-0116rHSA在不同表達系統(tǒng)中的比較-22011-04-0116目前除英國DETLA公司采用釀酒酵母作為宿主表達rHSA以外，其他公司和單位普遍采用畢赤酵母作為rHSA的表達宿主。2011-04-0117目前除英國DETLA公司采用釀酒酵母作為宿主表達rHS畢赤酵母表達重組人血清白蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建信號序列選擇①很多異源蛋白分泌表達時已具有成熟蛋白正確的N端氨基酸序列,且大部分分泌表達的異源蛋白是以它們自己同源信號序列引導的,分泌表達rHSA亦可以采用其自身的信號肽序列,即HSA引導肽序列。②rHSA的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信號序列，如來自Pichiapastoris的PHO5引導序列和來自S.cerevisiae的α-雜交因子(AMF)引導序列?；騽┝勘磉_載體單元插入到宿主菌表達系統(tǒng)時，可采用質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化到宿主菌細胞中呈附加體型載體(Episomalvector)存在,也可通過線型特異位點整合到酵母菌的染色體上。當外源基因表達單元呈整合型(Integrativetype)存在于染色體上時,因隨染色體的復制而復制,遺傳極其穩(wěn)定。2011-04-0118畢赤酵母表達重組人血清白蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建2011-04-01畢赤酵母表達重組人血清白蛋白rHSA的發(fā)酵過程包括二個階段,以甘油為碳源積累生物量的生長期和以甲醇為碳源的rHSA誘導表達期。甲醇的流加速率控制在培養(yǎng)基中的濃度小于1%,一般誘導表達150～300h左右。整個過程的pH控制在610左右,溶氧控制在10%以上。在兩段法的發(fā)酵條件優(yōu)化方面,發(fā)現(xiàn)將甘油和甲醇混合流加可提高rHSA產(chǎn)量,也就是誘導開始時首先流加甲醇,在確保醇氧化酶被誘導后,開始混合流加?；旌狭骷訒r嚴格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率,使發(fā)酵液中甘油不積累,同時甲醇濃度不超過0.5%。2011-04-0119畢赤酵母表達重組人血清白蛋白rHSA的發(fā)酵過程包括二個階段影響酵母表達外源蛋白的因素外源基因特性

主要涉及外源基因mRNA5′端非翻譯區(qū)、A+T組成和密碼子的使用頻率外源基因拷貝數(shù)和穩(wěn)定性釀酒酵母和一些其他的酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒是建成高拷貝表達載體基礎?？寺∥稽c影響外源基因表達的高效穩(wěn)定。一般情況下,畢赤甲醇酵母中外源基因整合的拷貝數(shù)愈高,則蛋白表達量愈大。2011-04-0120影響酵母表達外源蛋白的因素外源基因特性2011-04-01影響酵母表達外源蛋白的因素表達條件的優(yōu)化表達條件的優(yōu)化主要包括通氣量、培養(yǎng)基、搖菌密度、蛋白酶、誘導劑的含量等。充足的通氣量對于誘導階段外源蛋白的表達是極其重要的。有報道認為,如果用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),外源蛋白的表達水平要比普通搖瓶發(fā)酵高出10～100倍。通過調(diào)整培養(yǎng)基的pH值,在培養(yǎng)基中添加1%酪氨酸蛋白水解物等措施來抑制蛋白酶活性,使降解程度減至最低。此外選用蛋白酶缺陷的受體菌是減弱蛋白酶作用的有效方法誘導期間培養(yǎng)基中定期補充誘導劑,對于誘導表達外源蛋白十分重要。如對于畢赤甲醇酵母誘導期間培養(yǎng)基中每天應補加甲醇,以彌補甲醇的消耗和蒸發(fā)。誘導時間也是影響外源蛋白表達量的重要因素,誘導時間過短表達量低,誘導時間過長則外源蛋白降解增加2011-04-0121影響酵母表達外源蛋白的因素表達條件的優(yōu)化2011-04-0提高表達的一些策略啟動子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個組成型三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子PGAG,在它的控制下β-LabZ基因表達率比甲醇誘導下PAOX1驅(qū)動的產(chǎn)量更高,由于該組成型啟動子不需要甲醇誘導,發(fā)酵工藝更簡單,同時其產(chǎn)量更高,所以成為代替PAOX1最有潛力的啟動子。整合位點：酵母核糖體RNA的基因rDNA在染色體中具有100～200個重復,是提高外源基因拷貝數(shù)的最佳整合位點之一。宿主菌選擇：根據(jù)利用甲醇的能力不同,巴斯德畢赤酵母菌分為Mut+、Muts和Mut-3種表型。蛋白酶缺失的宿主菌可減少表達蛋白的酶解消化,有利于外源蛋白的穩(wěn)定。信號肽修飾：信號肽結(jié)構(gòu)的改變(如突變、修飾、融合等)可能會提高分泌效率。有研究發(fā)現(xiàn)，改造了的信號肽大大提高了外源蛋白表達量。2011-04-0122提高表達的一些策略啟動子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個降解控制改造P.pastoris表達宿主菌株,缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因穩(wěn)定。在培養(yǎng)液中補加一些富含氨基酸的組分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,或在培養(yǎng)基中加入YP(酵母提取物+蛋白胨),提供給酵母細胞蛋白酶過量的底物,以減少目的蛋白的降解加入蛋白酶抑制劑畢赤酵母在非緩沖培養(yǎng)基中生長表達,將pH降到3或更低,使得許多中性pH蛋白酶失活共表達蛋白酶抑制物來抑制蛋白酶活性,減少目的蛋白降解將目的蛋白連上一個過氧化物酶體靶向信號使其被分揀轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體貯存起來,免受蛋白酶降解,還可減少對宿主細胞的毒害作用2011-04-0123降解控制改造P.pastoris表達宿主菌株,缺失基因重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化漢遜酵母同巴斯德畢赤酵母一樣均是甲基營養(yǎng)型酵母，有相似的特性二者啟動子類型、外源基因整合方式、甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控機制、篩選標記等方面存在差異漢遜酵母重組菌遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、表達量和分泌效率高、適合于大規(guī)模發(fā)酵，是當前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統(tǒng)之一國內(nèi)大連漢信生物制藥生產(chǎn)的漢遜酵母重組乙肝疫苗自2004年投放市場由于其更高的抗體水平、更高的陽轉(zhuǎn)率、更高的母嬰阻斷率而備受市場青睞2011-04-0124重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化漢遜酵母同巴斯德畢赤重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化2006年，大連漢信生物制藥有限公司與大連理工大學合作開發(fā)研究試驗方法：優(yōu)化HSA編碼基因密碼子

選用畢赤酵母最偏愛或次偏愛的密碼子對HAS基因密碼序列進行優(yōu)化構(gòu)建rHSA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母細胞篩選重組表達株

液培，誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS、Westernblotting分析得到相對高表達的菌株

2011-04-0125重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化2011-04-01重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化發(fā)酵分離純化

StreamlineSP離子交換層析、PhenylSepharoseHP疏水層析、DEAESepharoseCL-6B陰離子交換層析抗原性分析ELISA、免疫雙擴散測定2011-04-0126重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化發(fā)酵2011-04-實驗結(jié)果證實rHSA在漢遜酵母中可得到高效表達，在搖瓶培養(yǎng)條件下表達量可占外泌蛋白的80%以上。重組菌經(jīng)高密度發(fā)酵，其表達量可達到1.033g/L，由發(fā)酵時間與rHSA濃度關(guān)系曲線分析：影響產(chǎn)量和產(chǎn)率的主要因素為蛋白酶的降解作用，降低蛋白酶的降解作用進行發(fā)酵條件優(yōu)化后rHSA表達量會有大幅度提升，可以進行工藝放大研究。分離純化手段有待提高2011-04-0127實驗結(jié)果證實rHSA在漢遜酵母中可得到高效表達，在搖瓶培人血清白蛋白融合技術(shù)研制長效蛋白藥物蛋白融合技術(shù)，是通過基因重組手段將蛋白質(zhì)藥物基因與特定的載體蛋白基因融合，由同一調(diào)控元件控制基因表達產(chǎn)物，目前使用最多的蛋白載體是ＨＳＡ和抗體Ｆｃ片段。干擾素是一類重要的家族性細胞因子，具有抵抗病毒感染，抑制腫瘤生長和調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。但是干擾素分子量大約19kDa，易被腎小球濾過，血漿半衰期短而治療周期長，需要頻繁注射給藥，患者依從性較低。中國藥科大學田碩、姚文兵等報道利用白蛋白融合技術(shù)構(gòu)建了能夠分泌表達ＨＳＡ與高活性新型干擾素（ＮＩＦＮ）的融合蛋白的巴斯德畢赤酵母工程菌株，獲得了高純度的長效新型干擾素分子。新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和純化—2010《中國生物工程雜志》2011-04-0128人血清白蛋白融合技術(shù)研制長效蛋白藥物蛋白融合技術(shù)，是通過基因新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和純化基本步驟：全基因合成質(zhì)粒：pBluscriptⅡKS（+）-NFIN-HSA合成質(zhì)粒與畢赤酵母表達載體體pPIC3.5構(gòu)建重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母、陽性克隆篩選重組畢赤酵母的PCR鑒定重組子的誘導表達HSA-NIFN的純化Westernblot鑒定重組蛋白質(zhì)譜和氨基酸序列分析融合蛋白體HAS-NIFN外抗病毒活性測定2011-04-0129新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和“新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和純化”應用的一部分策略根據(jù)已報道的基因序列及巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因的偏愛密碼子，設計了編碼HSA-NIFN的全新基因。HSA融合會顯著降低IFN的體外生物學活性。將其165位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸，以消除畢赤酵母體內(nèi)水解酶KEX-Ⅱ的作用位點；同時選用常見的G4S連接肽保證HSA和IFN之間的靈活性。選用HSA天然信號肽來介導HSA-NIFN分泌表達以避免可能出現(xiàn)的序列不均一的問題。2011-04-0130“新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達結(jié)構(gòu)分析對于疫苗等微量輸人的重組蛋白來說，99.999%的純度已經(jīng)足夠，但相對于rHSA該純度依然很低，因為白蛋白每次注射量至少10g，這意味著至少有0.Img的雜質(zhì)同時輸人人體，若其為有害雜質(zhì)，將可能產(chǎn)生生命危險。目前rHSA純化研究已取得很多突破性進展，已有純度高達99.999999%的研究報道，同時純化得到的高純度rHSA與pHSA在分子結(jié)構(gòu)上完全相同，且SDS分析、HPLC分析及配基結(jié)合能力均相同。2011-04-0131結(jié)構(gòu)分析對于疫苗等微量輸人的重組蛋白來說，99.999%的純重組人血清白蛋白臨床研究

英國的DELT公司用釀酒酵母生產(chǎn)的rHSA完成了一期臨床試驗。日本三菱公司用畢赤酵母生產(chǎn)的rHSA已經(jīng)完成了三期臨床試驗。2011-04-0132重組人血清白蛋白臨床研究英國的DELT公司用釀酒酵母rHSA的應用展望替代人血源HSA產(chǎn)品。由于HSA是一種多功能蛋白，因其具有無酶活性且無免疫原性等特點，rHSA可作為賦形劑和穩(wěn)定劑及無血清細胞培養(yǎng)基的組分。此外由于具有抗氧化性，rHSA也被用作藥物載體從而賦予藥物更好的理化特性(肽類和蛋白質(zhì)類藥物在體內(nèi)很難滲透進入血腦屏障,但通過嵌合肽可實現(xiàn)肽或蛋白質(zhì)藥物向腦的轉(zhuǎn)運。)。rHSA的廣泛應用將為人類血液和血液制品翻開新的篇幅。2011-04-0133rHSA的應用展望替代人血源HSA產(chǎn)品。由于HSA是一種多

THANKS2011-04-01342011-04-0134人血清白蛋白的酵母重組表達研究進展2011.04.012011-04-0135人血清白蛋白的酵母重組表達研究進展2011-04-011人血清白蛋白供需不平衡監(jiān)管嚴格采血站數(shù)量下降血液傳染病病毒泛濫不再審批新的生產(chǎn)企業(yè)進口受到嚴格限制需求量巨大2011年02月12日有文章稱《血液制品“告荒”》國內(nèi)血液制品的嚴重短缺。這類產(chǎn)品，除了人血白蛋白，其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、靜脈丙種球蛋白等都處于嚴重短缺的狀態(tài)。來源網(wǎng)址：鳳凰網(wǎng)財經(jīng)頻道/roll/20110212/3389405.shtml2011-04-0136人血清白蛋白供需不平衡監(jiān)管嚴格2011-04-012主要內(nèi)容國內(nèi)外進展酵母表達體系的建立rHSA在畢赤酵母的表達影響酵母表達外源蛋白的因素提高rHSA表達的一些策略rHSA在漢遜酵母中的表達與純化新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達和純化rHSA結(jié)構(gòu)分析rHSA的應用展望2011-04-0137主要內(nèi)容國內(nèi)外進展2011-04-013國內(nèi)外研究進展LawnR.M.等在1981年首次報道了重組人血白蛋白(RecombinantHumanSerumAlbumin,rHSA)cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)啟動子，色氨酸引導肽及來自質(zhì)粒pBR322的Tcr和Ampr基因構(gòu)建了第一個表達重組人血白蛋自的表達載體pHSAI并在大腸桿菌(E.coli)中得到了成功表達。HSA在大腸桿菌中表達量為細胞總蛋白的7%，但由于HSA含有大量的二硫鍵使得其在體外極難完成正確折疊，未能得到有生物功能的蛋白;同時細菌細胞壁脂多糖造成熱反應也帶來很多麻煩。2011-04-0138國內(nèi)外研究進展2011-04-014國外研究進展國外許多實驗室和公司在重組白蛋白方面進行了大量研究，如英國的DELTA公司，美國的GENETECH公司以及日本的三菱公司等。日本在重組人血白蛋白方面的研究走在了最前面。1994年日本的綠十字GREENCROSS（三菱公司的前身)公司被批準進人二期臨床，現(xiàn)在日本三菱公司已完成三期臨床。該公司已經(jīng)建廠進行大規(guī)模生產(chǎn)，一期工程完畢可達12.5噸/年的生產(chǎn)能力，并計劃逐步提高到40噸/年，已預定商品名“Albrec”,所生產(chǎn)的產(chǎn)品純度可達99.999999%,英DELTA公司已經(jīng)完成一期臨床試驗，美國等正處于臨床前研究階段。2011-04-0139國外研究進展國外許多實驗室和公司在重組白蛋白方面進行了大量研國內(nèi)研究進展近幾年來，我國也掀起了重組HSA的研究熱潮，華北制藥集團、中科院上海生化所、華東理工大學、中山醫(yī)科大學、中科院微生物所、過程工程研究所，以及安徽中科大亞杰科技股份有限公司等單位己經(jīng)開始利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)白蛋白的研究;目前我國在這方面的研究工作已經(jīng)取得一定進展。華東理工大學郭美錦，儲炬等于2000年發(fā)表文章稱該校生物反應器工程國家重點實驗室已經(jīng)采用Pichiapastoris進行了高密度高表達發(fā)酵研究,表達水平已達到5克/升左右。2011-04-0140國內(nèi)研究進展近幾年來，我國也掀起了重組HSA的研究熱潮，華北來源網(wǎng)址：/redirect.php?tid=3180088&goto=lastpost

華北制藥：藥用基因工程重組人血白蛋白研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化項目華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司從1997年開始采用畢赤酵母作為宿主菌分泌表達重組人血白蛋（rHSA）。經(jīng)過多年的努力，通過與國內(nèi)外有關(guān)單位協(xié)作，已建立了從菌種構(gòu)建至發(fā)酵、純化的完整工藝。已得到穩(wěn)定高效表達人血白蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株完成了中試研究，開發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的純化工藝路線。制定了重組人血白蛋白的質(zhì)量標準草案，中試規(guī)模制備的樣品各項指標檢定合格。本項目內(nèi)容為按照現(xiàn)行CMP要求開發(fā)規(guī)模生產(chǎn)藝．建設藥用重組白蛋白生產(chǎn)基地，年生產(chǎn)規(guī)模達到噸級。市場分析，白蛋白總銷售量為120-150噸左右。2011-04-0141來源網(wǎng)址：/redir來源網(wǎng)址：/Article/430719/1外界傳聞：華北制藥：馬上要公告獲得人造白蛋白。

事實上有消息源確認重組人血白蛋白馬上投產(chǎn)就等批文

可以理解為一旦批文下發(fā)，馬上投產(chǎn)

市場價人造白蛋白10克500塊

公司設計產(chǎn)能15噸

15噸產(chǎn)能，預計

2010

年底建成，2011

年初投產(chǎn)

新聞：

2011中國人血白蛋白制品360°產(chǎn)業(yè)論壇

時間：

2011-3-18

至

2011-3-19

地點：上海和頤酒店

主辦單位：

世易傳媒

2011-04-0142來源網(wǎng)址：來源網(wǎng)址：/Article/430719/1基因重組人血白蛋白與華北制藥

王平華北制藥股份有限公司董事長

關(guān)于產(chǎn)品簡介：重組人血白蛋白未來將成為重磅產(chǎn)品

同人血白蛋白相比，重組人血白蛋白不僅純度更高，而且可以有效地避免人血白蛋白攜帶病毒的風險，另外還可以解決血源供應的周期性等問題。因此，重組人血白蛋白實現(xiàn)大規(guī)模量產(chǎn)在血液制品行業(yè)將具有革命意義。

受益于國內(nèi)血制品行業(yè)的高景氣度，該產(chǎn)品的市場潛力巨大。人血白蛋白市場供應缺口較大，并且這種局面不會在短時間改善?；蛑亟M人血白蛋白是人血白蛋白的替代產(chǎn)品。至今，在國際上掌握重組白蛋白的廠商也只有三家，日本綠十字、英國

Delta

公司和美國的默克。國內(nèi)除華北制藥外尚無單位能規(guī)?；a(chǎn)重組白蛋白項目。華北制藥除培養(yǎng)基級白蛋白外還掌握了更高級別的白蛋白技術(shù)，白蛋白產(chǎn)品純化技術(shù)已經(jīng)達到國際上先進水平。2011-04-0143來源網(wǎng)址：rHSA表達體系的建立隨著基因重組技術(shù)所表達蛋白的復雜性越來越高，酵母作為真核生物具有能對所表達的蛋白進行翻譯后修飾，易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點逐漸取代大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白。在HSA的重組研究過程中，人們分別采用了釀酒酵母、漢遜醉母、裂殖酵母、克魯維氏酵母、畢赤酵母等作為宿主細胞，以及轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物來分泌表達重組人血白蛋白。2011-04-0144rHSA表達體系的建立隨著基因重組技術(shù)所表達蛋白的復雜性越人重組白蛋白不同表達體系的對比技術(shù)可行性表達量提取、純化安全性活性細菌可行毫克級難度高，后修飾困難-低酵母可行克級。國外有報道，達到5g/L,7g/L難度小。外分泌，可完成信號肽切除高高動物技術(shù)不成熟，實驗室階段高容易安全高植物可行，在馬鈴薯有成功表達，不成熟----2011-04-0145人重組白蛋白不同表達體系的對比技術(shù)可行性表達量提取、純化安全酵母表達體系的建立畢赤酵母由于分泌蛋白量高、表達穩(wěn)定，且70年代人們曾廣泛使用畢赤酵母生產(chǎn)單細胞蛋白，已基本掌握其生長規(guī)律及大規(guī)模高密度發(fā)酵技術(shù)，采用甲醇誘導強啟動子AOX，起始轉(zhuǎn)錄人血白蛋白，將表達質(zhì)粒整合到Pichiapastoris的基因組染色體上，表達質(zhì)粒不會因酵母傳代而丟失，可穩(wěn)定表達目的產(chǎn)物，且表達量高，用甲醇誘導時，表達率可占分泌總蛋白的80%以上。這非常有利于產(chǎn)物的提取。2011-04-0146酵母表達體系的建立畢赤酵母由于分泌蛋白量高、表達穩(wěn)定，且70酵母細胞表達系統(tǒng)中常用載體2011-04-0147酵母細胞表達系統(tǒng)中常用載體2011-04-0113不同酵母表達體系比較釀酒酵母畢赤酵母漢遜酵母2011-04-0148不同酵母表達體系比較釀酒酵母2011-04-0114rHSA常用表達系統(tǒng)中的比較-12011-04-0149rHSA常用表達系統(tǒng)中的比較-12011-04-0115rHSA在不同表達系統(tǒng)中的比較-22011-04-0150rHSA在不同表達系統(tǒng)中的比較-22011-04-0116目前除英國DETLA公司采用釀酒酵母作為宿主表達rHSA以外，其他公司和單位普遍采用畢赤酵母作為rHSA的表達宿主。2011-04-0151目前除英國DETLA公司采用釀酒酵母作為宿主表達rHS畢赤酵母表達重組人血清白蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建信號序列選擇①很多異源蛋白分泌表達時已具有成熟蛋白正確的N端氨基酸序列,且大部分分泌表達的異源蛋白是以它們自己同源信號序列引導的,分泌表達rHSA亦可以采用其自身的信號肽序列,即HSA引導肽序列。②rHSA的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信號序列，如來自Pichiapastoris的PHO5引導序列和來自S.cerevisiae的α-雜交因子(AMF)引導序列?；騽┝勘磉_載體單元插入到宿主菌表達系統(tǒng)時，可采用質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化到宿主菌細胞中呈附加體型載體(Episomalvector)存在,也可通過線型特異位點整合到酵母菌的染色體上。當外源基因表達單元呈整合型(Integrativetype)存在于染色體上時,因隨染色體的復制而復制,遺傳極其穩(wěn)定。2011-04-0152畢赤酵母表達重組人血清白蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建2011-04-01畢赤酵母表達重組人血清白蛋白rHSA的發(fā)酵過程包括二個階段,以甘油為碳源積累生物量的生長期和以甲醇為碳源的rHSA誘導表達期。甲醇的流加速率控制在培養(yǎng)基中的濃度小于1%,一般誘導表達150～300h左右。整個過程的pH控制在610左右,溶氧控制在10%以上。在兩段法的發(fā)酵條件優(yōu)化方面,發(fā)現(xiàn)將甘油和甲醇混合流加可提高rHSA產(chǎn)量,也就是誘導開始時首先流加甲醇,在確保醇氧化酶被誘導后,開始混合流加?；旌狭骷訒r嚴格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率,使發(fā)酵液中甘油不積累,同時甲醇濃度不超過0.5%。2011-04-0153畢赤酵母表達重組人血清白蛋白rHSA的發(fā)酵過程包括二個階段影響酵母表達外源蛋白的因素外源基因特性

主要涉及外源基因mRNA5′端非翻譯區(qū)、A+T組成和密碼子的使用頻率外源基因拷貝數(shù)和穩(wěn)定性釀酒酵母和一些其他的酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒是建成高拷貝表達載體基礎。克隆位點影響外源基因表達的高效穩(wěn)定。一般情況下,畢赤甲醇酵母中外源基因整合的拷貝數(shù)愈高,則蛋白表達量愈大。2011-04-0154影響酵母表達外源蛋白的因素外源基因特性2011-04-01影響酵母表達外源蛋白的因素表達條件的優(yōu)化表達條件的優(yōu)化主要包括通氣量、培養(yǎng)基、搖菌密度、蛋白酶、誘導劑的含量等。充足的通氣量對于誘導階段外源蛋白的表達是極其重要的。有報道認為,如果用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),外源蛋白的表達水平要比普通搖瓶發(fā)酵高出10～100倍。通過調(diào)整培養(yǎng)基的pH值,在培養(yǎng)基中添加1%酪氨酸蛋白水解物等措施來抑制蛋白酶活性,使降解程度減至最低。此外選用蛋白酶缺陷的受體菌是減弱蛋白酶作用的有效方法誘導期間培養(yǎng)基中定期補充誘導劑,對于誘導表達外源蛋白十分重要。如對于畢赤甲醇酵母誘導期間培養(yǎng)基中每天應補加甲醇,以彌補甲醇的消耗和蒸發(fā)。誘導時間也是影響外源蛋白表達量的重要因素,誘導時間過短表達量低,誘導時間過長則外源蛋白降解增加2011-04-0155影響酵母表達外源蛋白的因素表達條件的優(yōu)化2011-04-0提高表達的一些策略啟動子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個組成型三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子PGAG,在它的控制下β-LabZ基因表達率比甲醇誘導下PAOX1驅(qū)動的產(chǎn)量更高,由于該組成型啟動子不需要甲醇誘導,發(fā)酵工藝更簡單,同時其產(chǎn)量更高,所以成為代替PAOX1最有潛力的啟動子。整合位點：酵母核糖體RNA的基因rDNA在染色體中具有100～200個重復,是提高外源基因拷貝數(shù)的最佳整合位點之一。宿主菌選擇：根據(jù)利用甲醇的能力不同,巴斯德畢赤酵母菌分為Mut+、Muts和Mut-3種表型。蛋白酶缺失的宿主菌可減少表達蛋白的酶解消化,有利于外源蛋白的穩(wěn)定。信號肽修飾：信號肽結(jié)構(gòu)的改變(如突變、修飾、融合等)可能會提高分泌效率。有研究發(fā)現(xiàn)，改造了的信號肽大大提高了外源蛋白表達量。2011-04-0156提高表達的一些策略啟動子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個降解控制改造P.pastoris表達宿主菌株,缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因穩(wěn)定。在培養(yǎng)液中補加一些富含氨基酸的組分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,或在培養(yǎng)基中加入YP(酵母提取物+蛋白胨),提供給酵母細胞蛋白酶過量的底物,以減少目的蛋白的降解加入蛋白酶抑制劑畢赤酵母在非緩沖培養(yǎng)基中生長表達,將pH降到3或更低,使得許多中性pH蛋白酶失活共表達蛋白酶抑制物來抑制蛋白酶活性,減少目的蛋白降解將目的蛋白連上一個過氧化物酶體靶向信號使其被分揀轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體貯存起來,免受蛋白酶降解,還可減少對宿主細胞的毒害作用2011-04-0157降解控制改造P.pastoris表達宿主菌株,缺失基因重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化漢遜酵母同巴斯德畢赤酵母一樣均是甲基營養(yǎng)型酵母，有相似的特性二者啟動子類型、外源基因整合方式、甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控機制、篩選標記等方面存在差異漢遜酵母重組菌遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、表達量和分泌效率高、適合于大規(guī)模發(fā)酵，是當前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統(tǒng)之一國內(nèi)大連漢信生物制藥生產(chǎn)的漢遜酵母重組乙肝疫苗自2004年投放市場由于其更高的抗體水平、更高的陽轉(zhuǎn)率、更高的母嬰阻斷率而備受市場青睞2011-04-0158重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化漢遜酵母同巴斯德畢赤重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化2006年，大連漢信生物制藥有限公司與大連理工大學合作開發(fā)研究試驗方法：優(yōu)化HSA編碼基因密碼子

選用畢赤酵母最偏愛或次偏愛的密碼子對HAS基因密碼序列進行優(yōu)化構(gòu)建rHSA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母細胞篩選重組表達株

液培，誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS、Westernblotting分析得到相對高表達的菌株

2011-04-0159重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化2011-04-01重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化發(fā)酵分離純化

StreamlineSP離子交換層析、PhenylSepharoseHP疏水層析、DEAESepharoseCL-6B陰離子交換層析抗原性分析ELISA、免疫雙擴散測定2011-04-0160重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達與純化發(fā)酵2011-04-實驗結(jié)果證實rHSA在漢遜酵母中可得到高效表達，在搖瓶培養(yǎng)條件下表達量可占外泌蛋白的80%以上。重組菌經(jīng)高密度發(fā)酵，其表達量可達到1.033g/L，由發(fā)酵時間與rHSA濃度關(guān)系曲線分析：影響產(chǎn)量和產(chǎn)率的主要因素為蛋白酶的降解作用，降低蛋白酶的降解作用進行發(fā)酵條件優(yōu)化后rHSA表達量會有大幅度提升，可以進行工藝放大研究。分離純化手段有待提高2011-04-0161實驗結(jié)果證實rHSA在