第四章比色分析(fēnxī)與分光光度分析(fēnxī)第一頁，共107頁。2022/11/241比色法的發(fā)展(fāzhǎn)比色法(colorimetry)是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定(quèdìng)待測組分含量的方法.（1）早在公元初古希臘人就曾用五倍子溶液測定醋中的鐵。（2）1795年，俄國人也用五倍子的酒精溶液測定礦泉水中的鐵。（3）比色法作為一種定量分析的方法，大約開始于19世紀(jì)30～40年代。（4）20世紀(jì)30～60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時期，此后就逐漸為分光光度法所代替。第二頁，共107頁。2022/11/242第一節(jié)概述1光度分析法的特點2物質(zhì)對光的選擇性吸收3光吸收的基本定律4常用儀器(yíqì)5顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇6影響比色與分光光度分析的因素第三頁，共107頁。2022/11/2431光度(guāngdù)分析法的特點有色物質(zhì)顏色的深淺和濃度有關(guān)，利用比較溶液(róngyè)顏色深淺來測定含量的分析方法稱為比色分析法。目視比色稱為比色法；利用分光光度計測試，稱為分光光度法。光度分析法特點：(1)具有較高的靈敏度。一般物質(zhì)可測到10-3~10-6molL-1(2)有一定的準(zhǔn)確度。相對誤差為2%~5%(3)操作簡便、快速，選擇性好，儀器設(shè)備簡單。(4)應(yīng)用廣泛。第四頁，共107頁。2022/11/2442物質(zhì)(wùzhì)對光的選擇性吸收在可見光區(qū)(400~760nm)不同波長的光具有不同的顏色。溶液呈現(xiàn)(chéngxiàn)一定的顏色是對光選擇性吸收的結(jié)果。當(dāng)一束白光通過一有色溶液時，某些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過，溶液的顏色由透過光決定。透射光與吸收光又可組成白光，這兩種光稱為互補(bǔ)色光。第五頁，共107頁。2022/11/245如CuSO4溶液呈藍(lán)色就是吸收(xīshōu)了白光中黃光。第六頁，共107頁。2022/11/246如果將不同波長的光通過一固定(gùdìng)濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度（吸光度A），然后以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得一曲線，稱吸收曲線。第七頁，共107頁。2022/11/247圖中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三條曲線，代表同一(tóngyī)被測物質(zhì)含量由高到低的吸收曲線。鄰二氮雜菲亞鐵溶液的吸收(xīshōu)曲線第八頁，共107頁。2022/11/248（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（3）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏(línɡm(xù)ǐn)。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。第九頁，共107頁。2022/11/2493光吸收的基本(jīběn)吸收定律（1）朗伯-比爾定律（2）吸光度(guāngdù)的加和性（3）對朗伯-比爾定律的偏離第十頁，共107頁。2022/11/2410（1）朗伯-比爾定律(dìnglǜ)當(dāng)一束(yīshù)平行的單色光通過均勻、透明的有色溶液時，如溶液的濃度越大、液層厚度越大，則光強(qiáng)度的減弱越顯著。I0：入射光強(qiáng)度(qiángdù)；It：透射光強(qiáng)度(qiángdù)

“A”

稱為吸光度，量綱為1

。溶液對光的吸收程度越大，則透射光強(qiáng)度越小，A越大。第十一頁，共107頁。2022/11/2411吸光度(guāngdù)測量中，也用透光度(guāngdù)T表示透過(tòuɡuò)光強(qiáng)度越大，T值越大。第十二頁，共107頁。2022/11/2412b：液層的厚度cm；c：溶液的濃度g·L-1K：吸光系數(shù)L·g-1·cm-1如“c”的單位：mol·L-1，此時的吸光系數(shù)稱為(chēnɡwéi)摩爾吸光系數(shù)kk：摩爾(móěr)吸光系數(shù)L·mol-1·cm-1式中M為摩爾(móěr)質(zhì)量第十三頁，共107頁。2022/11/2413k是吸光物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)。在溫度和波長等條件一定時，k僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)。k是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，k值越大，光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。由實驗結(jié)果計算時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，這樣計算的k值實際上是表觀摩爾(móěr)吸光系數(shù)。第十四頁，共107頁。2022/11/2414例：已知含F(xiàn)e2+濃度為·L-1的溶液，用鄰二氮菲光度法測定(cèdìng)鐵(Fe2+與鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色配合物)。使用厚度為2cm的吸收池，在波長510nm處測得吸光度。計算該配合物的摩爾吸光系數(shù)。。解：已知鐵的相對原子質(zhì)量為。第十五頁，共107頁。2022/11/2415（2）吸光度(guāngdù)的加和性在含有多組分的體系中，若各組分對同一波長的光都有吸光作用，且各組分的吸光物質(zhì)彼此不發(fā)生作用，則測得的吸光度(guāngdù)等于各組分的吸光度(guāngdù)之和。A=A1+A2+…+A3第十六頁，共107頁。2022/11/2416（3）對朗伯-比爾定律(dìnglǜ)的偏離比爾定律的局限性非單色入射光引起的偏離由于溶液本身(běnshēn)發(fā)生化學(xué)變化的原因引起的偏離第十七頁，共107頁。2022/11/2417比爾定律(dìnglǜ)的局限性通常在用分光光度法進(jìn)行分析時，多采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法。即固定液層厚度、入射光的波長(bōcháng)，測定一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，此時A與c應(yīng)成直線關(guān)系。在實際(shíjì)工作上，特別是在濃度較高時，常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不為直線，即偏離了朗伯—比爾定律。第十八頁，共107頁。2022/11/2418比爾定律是一個有限制性的定律，它假設(shè)入射光為單色光，吸收粒子間沒有干擾。因此(yīncǐ)僅在稀溶液中才適用。在高濃度時，由于吸光物質(zhì)微粒間相互影響，從而改變了它對光的吸收能力，使吸光度與濃度的線性關(guān)系發(fā)生偏離。第十九頁，共107頁。2022/11/2419非單色光引起(yǐnqǐ)的偏離比爾定律假設(shè)入射光為單色光，但是目前儀器所能提供的入射光不是嚴(yán)格的單色光，是由波長范圍較窄的光帶(ɡuānɡdài)組成的復(fù)合光。A=kbc，k在一定波長下是一常數(shù)，如入射光不為單色光，則k不為常數(shù)，A與c不成直線關(guān)系。第二十頁，共107頁。2022/11/2420在最大吸收波長附近通常有一個吸收強(qiáng)度相差較小的區(qū)域，如入射光在此范圍內(nèi)，因k變化(biànhuà)較小，引起的偏離也較小，A與c基本上呈直線關(guān)系。

λ

Aλmax第二十一頁，共107頁。2022/11/2421

由于溶液本身(běnshēn)發(fā)生化學(xué)變化

的原因引起的偏離

由于被測物質(zhì)在溶液中發(fā)生締合、離解或溶劑化、互變異構(gòu)、配合物的逐級形成等化學(xué)(huàxué)因素，造成對比耳定律的偏離。Cr2O72-+H2O2CrO42-+2H+橙色(chénɡsè)黃色

應(yīng)控制條件，使溶液中僅存在Cr2O72-或CrO42-

，這樣，c與A之間才成直線第二十二頁，共107頁。2022/11/24224比色法和分光(fēnɡuānɡ)光度法及其儀器目視(mùshì)比色法與光電比色法分光光度計的基本部件常用的幾種分光光度計第二十三頁，共107頁。2022/11/2423目視(mùshì)比色法目視比色法是一種(yīzhǒnɡ)用眼睛辨別溶液顏色的深淺，以確定帶測組分含量的方法。常用標(biāo)準(zhǔn)系列法，在一套等體積的比色管中，加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入等量顯色劑及其它試劑，待測液在同樣條件下顯色。稀釋至刻度，搖勻。比較待測液和標(biāo)準(zhǔn)色階溶液的顏色深淺，確定待測液的濃度。目視比色法儀器簡單，操作簡便，但準(zhǔn)確度較差。第二十四頁，共107頁。2022/11/2424光電比色法是在光電比色計上測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制(huìzhì)工作曲線，然后根據(jù)待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。第二十五頁，共107頁。2022/11/2425光電比色法與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準(zhǔn)確度，而且可以通過選擇(xuǎnzé)濾光片和參比溶液來消除干擾，從而提高了選擇(xuǎnzé)性。第二十六頁，共107頁。2022/11/2426分光(fēnɡuānɡ)光度計的基本部件a.光源作用：發(fā)出所需波長(bōcháng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜。要求具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)常用鎢燈、或碘鎢燈，波長(bōcháng)范圍：320~2500nm光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)讀數(shù)指示器第二十七頁，共107頁。2022/11/2427b.單色器作用：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光。單色器由棱鏡和光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入(jìnrù)單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。第二十八頁，共107頁。2022/11/2428c.吸收池作用：用于盛放試樣溶液。也叫比色皿。吸收池主要有石英和玻璃兩種。在紫外區(qū)須采用石英吸收池，可見區(qū)一般(yībān)用玻璃吸收池。吸收池大多是長方形的，一般(yībān)儀器都配有一套厚度為、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置的位置應(yīng)使透光面垂直于光束方向。第二十九頁，共107頁。2022/11/2429d.檢測系統(tǒng)作用：將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電流進(jìn)行測量。光電轉(zhuǎn)換器對測定波長范圍內(nèi)的光有快速靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的電流應(yīng)與光電轉(zhuǎn)換器上的光強(qiáng)度成正比。常用(chánɡyònɡ)的光電轉(zhuǎn)換器有硒光電池、光電管。e.讀數(shù)指示器作用：把光電流或放大的信號以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來。第三十頁，共107頁。2022/11/2430常用(chánɡyònɡ)的幾種分光光度計72型、722型、751型等。第三十一頁，共107頁。2022/11/2431比色分析是否(shìfǒu)等同于分光光度分析？光電比色計和紫外－可見分光光度計的光路結(jié)構(gòu)非常相似，它們之間不同的地方在于：①分光光度計采用棱鏡或光柵作色散元件，因而可以得到純度較高的單色光束。而光電比色計采用濾光片，只能得到一定波長范圍的光譜(guāngpǔ)帶(復(fù)合光)；第三十二頁，共107頁。2022/11/2432②紫外－可見分光光度計采用紫外和可見區(qū)的光源，即氫燈和鎢燈，而光電比色計只用一種鎢燈光源，因而前者適用(shìyòng)于紫外－可見光譜區(qū)，而后者只適用(shìyòng)于可見光譜區(qū)；第三十三頁，共107頁。2022/11/2433③紫外－可見分光(fēnɡuānɡ)光度計可以測定待測組分的精細(xì)吸收光譜，不僅可用于定量分析，而且可以作有機(jī)化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析，而光電比色計只能作定量分析；第三十四頁，共107頁。2022/11/2434④分光光度計一般都采用靈敏度高的光電倍增管作檢測器，而光電比色計一般用光電池或光電管作檢測器。因此，光電比色計無論在測量的準(zhǔn)確度、靈敏度和應(yīng)用(yìngyòng)范圍上都不如紫外－可見分光光度計。第三十五頁，共107頁。2022/11/2435比色法是以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)(jīchǔ)的，一般包括兩個步驟：首先是選擇適當(dāng)?shù)娘@色試劑與待測組分反應(yīng)，形成有色化合物，然后再比較或測量有色化合物的顏色深度。反應(yīng)(fǎnyìng)顯色劑+待測組分(zǔfèn)測定顏色深淺顯色反應(yīng)尤為重要5顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇第三十六頁，共107頁。2022/11/2436（1）對顯色(xiǎnsè)反應(yīng)的要求將待測組分轉(zhuǎn)化為有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。1.靈敏度高因為光度法一般用于測定(cèdìng)微量組分含量，故通常選擇靈敏度高的顯色反應(yīng)。生成的有色化合物摩爾吸光系數(shù)大，靈敏度高，通常k值達(dá)104~105，認(rèn)為靈敏度較高。2.選擇性好即顯色劑只與一種或少數(shù)幾種物質(zhì)反應(yīng)而顯色。3.有色化合物組成固定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定4.顯色劑在測定(cèdìng)波長處無明顯吸收第三十七頁，共107頁。2022/11/2437（2）顯色(xiǎnsè)反應(yīng)條件的選擇a．顯色劑的用量通常顯色反應(yīng)(fǎnyìng)可用下式表示：M(被測離子)+HR(顯色劑)MR+H+從平衡角度看，顯色劑過量越多，越有利于有色配合物的形成。但顯色劑過量太多，有時會引起(yǐnqǐ)副反應(yīng)，故有一適宜用量，通常由實驗確定。固定其它條件，改變顯色劑的濃度，測A，作A~c

R曲線，選擇原則：選擇曲線上平坦部分

第三十八頁，共107頁。2022/11/2438吸光度與顯色劑用量關(guān)系曲線cRcRcRAAA(a)適合進(jìn)行光度分析(對顯色劑濃度控制不嚴(yán)格(yángé))(b)只能選擇較窄的顯色劑濃度范圍(c)必須嚴(yán)格(yángé)控制顯色劑濃度。第三十九頁，共107頁。2022/11/2439b.酸度酸度對顯色反應(yīng)的影響是多方面的：H+濃度大，不利于有色配合物的形成；酸度還影響有些顯色劑的顏色；某些被測組分與顯色劑能形成不同組成的配合物；金屬離子在酸度下降時會水解。適宜(shìyí)的酸度范圍由實驗確定：固定其它條件，改變pH值測A，作A~pH曲線，選擇曲線平坦部分對應(yīng)的pH值作為測量條件。第四十頁，共107頁。2022/11/2440吸光度(guāngdù)與pH關(guān)系曲線pHA第四十一頁，共107頁。2022/11/2441c．顯色時的溫度和時間多數(shù)顯色反應(yīng)在室溫下能很快進(jìn)行，有些反應(yīng)需要加熱。多數(shù)顯色反應(yīng)須經(jīng)一定時間才能完成，有些有色(yǒusè)物質(zhì)放置時受到空氣和光的作用，顏色會減弱。適宜顯色時間可通過實驗確定。第四十二頁，共107頁。2022/11/2442AtAt(2)(1)(1)隨著時間的增加，有色化合物的濃度(nóngdù)增大，A增大。反應(yīng)完成后，A保持不變。(2)有色化合物性質(zhì)不太穩(wěn)定，隨著(suízhe)放置時間的增加，在日光，空氣的的作用下，有色化合物分解，濃度下降，A降低。第四十三頁，共107頁。2022/11/2443d.溶劑的影響許多有色配合物在水中解離度較大，而在有機(jī)溶劑中解離度較小。有些配合物易溶于有機(jī)溶劑。e.干擾物質(zhì)的影響及消除干擾離子本身有顏色或與顯色劑作用顯色等，都將干擾測定(cèdìng)。消除干擾的方法有：(1)加掩蔽劑(2)選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件如通過控制酸度，使干擾離子不作用(3)選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件如波長、參比溶液等(4)分離干擾離子第四十四頁，共107頁。2022/11/2444入射光波長(bōcháng)的選擇入射光波長應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線選擇。1)在一般情況下選擇最大吸收波長作為(zuòwéi)入射光的波長，因此時k最大，測定的靈敏度高；2)如干擾物在待測物的最大吸收波長處有強(qiáng)烈的吸收，則選擇非最大吸收波長作為(zuòwéi)入射光的波長，這時靈敏度雖有下降，但卻消除了干擾。分光光度法儀器(yíqì)測量誤差及其消除第四十五頁，共107頁。2022/11/2445曲線(qūxiàn)A為鈷絡(luò)合物的吸收曲線(qūxiàn)曲線(qūxiàn)B為顯色劑的吸收曲線(qūxiàn)吸光度測定(cèdìng)條件的選擇第四十六頁，共107頁。2022/11/2446光度計讀數(shù)(dúshù)范圍的選擇任何光度計都有一定的測量誤差，誤差來源于：入射光源不穩(wěn)定；吸收(xīshōu)池玻璃厚薄不均勻；池壁不夠平行、表面有水跡、油污或劃痕等；光電池不靈敏、疲勞現(xiàn)象及檢流計刻度不準(zhǔn)等。以上因素造成測量誤差的總和，表現(xiàn)為透光度讀數(shù)誤差△T。T與c之間是對數(shù)關(guān)系，同樣的△T對不同濃度造成的△c不同。在不同的吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)，引入的濃度測量誤差是不同的，因此必須選擇合適的吸光度讀數(shù)范圍。第四十七頁，共107頁。2022/11/2447為了減小測量的相對誤差(xiānɡduìwùchà)可采取如下措施：(1)控制溶液的濃度，如改變試樣的稱出量或改變稀釋度等。(2)如溶液已顯色，則可選擇合適厚度的比色皿，使吸光度在上述范圍內(nèi)。第四十八頁，共107頁。2022/11/2448參比溶液(róngyè)的選擇參比溶液(róngyè)用來調(diào)節(jié)儀器的零點，以消除吸收池壁及溶劑等對入射光的反射和吸收帶來的影響，使測得的吸光度能真正反映被測物質(zhì)的含量。選擇參比溶液(róngyè)的原則：(1)如果僅所測物質(zhì)有吸收，顯色劑及其它試劑均無吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈?，如蒸餾水；(2)如顯色劑和其他試劑略有吸收，則應(yīng)用不含被測組分的試劑溶液(róngyè)（空白溶液(róngyè)）作參比溶液(róngyè)；第四十九頁，共107頁。2022/11/2449(3)如果試樣中其他(qítā)組分有吸收，但不與顯色劑作用，當(dāng)顯色劑無吸收時，可用試樣溶液（不加顯色劑）作參比；當(dāng)顯色劑也略有吸收，或干擾離子也與顯色劑作用且產(chǎn)物有吸收，可在試液中加掩蔽劑，掩蔽待測組分，再加顯色劑，以此溶液作參比。第五十頁，共107頁。2022/11/2450溶液(róngyè)濃度的測定工作曲線法配制一系列不同濃度的被測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液(róngyè)，在選定的λmax和最佳操作條件下，測得吸光度，作工作曲線（A~c），為一直線，也叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同條件下，測得試樣溶液(róngyè)的吸光度，從工作曲線上查得相應(yīng)濃度。第五十一頁，共107頁。2022/11/24516、影響比色分析(fēnxī)的因素溶劑的種類和性質(zhì)；絡(luò)合物的電離(diànlí)度；所用的試劑濃度；反應(yīng)系統(tǒng)中氫離子濃度；試樣放置時間；試樣及環(huán)境的溫度；反應(yīng)系統(tǒng)中離子的干擾；儀器及實驗過程中的操作誤差。第五十二頁，共107頁。2022/11/2452一、比色分析(fēnxī)比色法：以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)(wùzhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法，比色法為一種定量分析的方法。第二節(jié)應(yīng)用(yìngyòng)實例二、分光光度分析第五十三頁，共107頁。2022/11/24531啤酒色度的測定啤酒色度是指啤酒顏色的深淺，是啤酒常規(guī)化驗項目之一啤酒色度的高低，主要取決于制麥工藝，但與糖化、發(fā)酵(fājiào)等其他工藝也有關(guān)。第五十四頁，共107頁。2022/11/2454啤酒色度的測定方法是以碘液做標(biāo)準(zhǔn)，取100毫升(háoshēnɡ)水，向其中滴加碘液，滴定至于啤酒顏色一致，所消耗碘液毫升(háoshēnɡ)數(shù)，即為啤酒色度。方法(fāngfǎ)一、第五十五頁，共107頁。2022/11/2455操作步驟試劑(shìjì)0.1N的碘液、超純水第五十六頁，共107頁。2022/11/2456實驗(shíyàn)結(jié)果色度（碘液毫升數(shù)/100毫升）=消耗(xiāohào)碘液毫升數(shù)X（碘液實際當(dāng)量濃度）第五十七頁，共107頁。2022/11/2457方法(fāngfǎ)二1．原理將除氣后的啤酒注入EBC比色計的比色皿中，與標(biāo)準(zhǔn)EBC色盤比較，目視讀數(shù)或自動數(shù)字顯示出啤酒的色度，以EBC色度單位(dānwèi)表示。EBC——歐洲啤酒(píjiǔ)協(xié)會，簡稱“歐啤協(xié)。”EuropeBeerconsortium第五十八頁，共107頁。2022/11/24582．儀器EBC比色計(或使用同等分析效果(xiàoguǒ)的儀器)：具有～27.0EBC單位的目視色度盤或自動數(shù)據(jù)處理與顯示裝置。第五十九頁，共107頁。2022/11/2459一般淡色啤酒的色度在～14.0EBC范圍(fànwéi)內(nèi)；濃色啤酒的色度在～40.0EBC范圍(fànwéi)內(nèi)。測定濃色或黑色啤酒時，需要將啤酒稀釋至合適的色度范圍(fànwéi)(即～27.0EBC范圍(fànwéi)內(nèi))，然后將實驗結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。第六十頁，共107頁。2022/11/24602白酒(báijiǔ)中甲醇含量的檢測甲醇對人體的毒性較大，4-10g即可引起嚴(yán)重中毒，尤其是甲醇的氧化物甲酸和甲醛。急性中毒，頭痛、惡心、視力模糊等，呼吸中樞麻痹，昏迷甚至死亡。慢性中毒表現(xiàn)為粘膜刺激癥狀，昏睡、頭痛、消化障礙、視力模糊、耳鳴等，以致雙目失明。第六十一頁，共107頁。2022/11/2461甲醇的檢測(jiǎncè)原理酒中甲醇在磷酸溶液(róngyè)中被高錳酸鉀氧化為甲醛，過量的高錳酸鉀及在反應(yīng)中產(chǎn)生二氧化錳用硫酸草酸溶液(róngyè)除去，甲醇與品紅亞硫酸作用生成藍(lán)紫色醌型色素，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。第六十二頁，共107頁。2022/11/2462儀器(yíqì)與試劑1．高錳酸鉀—磷酸(línsuān)溶液：稱取3g高錳酸鉀。加入15mL85%磷酸(línsuān)與70mL水的混合液中，溶解后加水至100mL，貯于棕色瓶內(nèi)，防止氧化力下降，保存時間不宜過長。2．草酸—硫酸溶液：稱取5g無水草酸或7g含2分子結(jié)晶水草酸，溶于1：1硫酸中至100mL。第六十三頁，共107頁。2022/11/24633．品紅—亞硫酸溶液：稱取堿性品紅研細(xì)后分次加入共60mL80°C的水，邊加水邊研磨使其溶解。用滴管吸取上層溶液過濾于100mL容量瓶中，冷卻后加10mL10%亞硫酸鈉溶液、1mL鹽酸，再加水至刻度，充分混勻，放置過夜，如溶液有顏色，可加少量活性炭減半后過濾，貯于棕色瓶中，置暗處保存，溶液呈紅色(hóngsè)時應(yīng)棄去重新配制。4．甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取甲醇，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于10mg甲醇。置低溫保存。第六十四頁，共107頁。2022/11/24646．無甲醇的乙醇溶液：取按操作方法檢查不應(yīng)顯色。如顯色需進(jìn)行處理。處理方法：取300mL95%乙醇，加高錳酸鉀少許，蒸餾，收集餾出液。在餾出液中加入硝酸銀溶液（取1g硝酸銀溶于少量水中）和氫氧化鈉溶液（取氫氧化鈉溶于少量水中）搖勻，取上清液蒸餾，棄去最初的50mL餾出液，收集中間(zhōngjiān)餾出液約200mL，用酒精比重計測其濃度，然后加水配成60%無甲醇的乙醇溶液。7．10%亞硫酸鈉溶液。第六十五頁，共107頁。2022/11/2465操作步驟1.根據(jù)樣品(yàngpǐn)中乙醇濃度適當(dāng)取樣（乙醇濃度30%取，40%取，50%取，60%?。?，置于25mL具塞比色管中。2.吸取、、、、、甲醇標(biāo)注使用液（相當(dāng)0、、、、、甲醇），分別置于10mL具塞比色管中，并加入0.5mL60%的無甲醇的乙醇溶液。第六十六頁，共107頁。2022/11/24663.于樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管中各加水至5mL，再依次各加2mL高錳酸鉀—磷酸溶液，混勻，放置10min，各加2mL草酸—硫酸溶液，混勻使之褪色，再各加5mL品紅—亞硫酸溶液，混勻，于20°C以上靜置，用2cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(línɡdiǎn)，于波長590nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，或與標(biāo)準(zhǔn)色列目測比較。第六十七頁，共107頁。2022/11/2467實驗(shíyàn)數(shù)據(jù)管號標(biāo)準(zhǔn)管23456吸光度0.0820.0780.0820.0850.0840.086第六十八頁，共107頁。2022/11/2468計算(jìsuàn)及結(jié)果第六十九頁，共107頁。2022/11/2469式中：X1—樣品(yàngpǐn)中甲醇的含量，g/100mL；A1__測定樣品(yàngpǐn)中甲醇的含量，mg；V1—樣品(yàngpǐn)體積，mL。第七十頁，共107頁。2022/11/24703白酒中雜醇油含量的檢測(jiǎncè)物理性質(zhì)：無色至黃色油狀液體。有特殊臭味和毒性。相對密度～0.832(20/20℃)。主要含有異戊醇、丁醇、丙醇和庚醇等。第七十一頁，共107頁。2022/11/2471有害物質(zhì)雜醇油雜醇油是酒的芳香成分之一。但含量過高，對人們有毒害作用，它的中毒和麻醉作用比乙醇強(qiáng)，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，使人頭痛，其毒性隨分子量增大(zēnɡdà)而加劇。雜醇油在體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，在機(jī)體內(nèi)停留時間較長。雜醇油的主要成分是異戊醇、戊醇、異丁醇、丙醇等，其中以異丁醇、異戊醇的毒性較大。原料中蛋白質(zhì)含量多時，酒中雜醇油的含量也高。雜醇油的沸點一般高于乙醇(乙醇沸點為78℃，丙醇為97℃，異戊醇為13l℃)。在白酒蒸餾時，應(yīng)掌握溫度，進(jìn)行掐頭去尾，減少成品酒的雜醇油含量。第七十二頁，共107頁。2022/11/2472檢測(jiǎncè)原理雜醇油的主要成分是異戊醇、戊醇、異丁醇、丙醇等，其中的異戊醇和異丁醇在硫酸(liúsuān)作用下分別生成戊烯和丁烯，再與對二甲氨基苯甲醛作用生成在520nm出有吸收峰的橙色物質(zhì)。其吸光度與異戊醇和異丁醇的含量成正比關(guān)系，通過與標(biāo)準(zhǔn)比較可實現(xiàn)定量分析。第七十三頁，共107頁。2022/11/2473儀器(yíqì)與試劑1.0.5%對二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液---稱取0.5g對二甲氨基苯甲醛,加濃硫酸溶解至l00m1,貯于棕色瓶中,如有色應(yīng)重新配制。

2.無雜醇油的乙醇---取0.1ml分析純無水乙醇,進(jìn)行顯色檢查(jiǎnchá),不得顯色,如顯色取分析純無水乙醇200m1,加0.25g鹽酸間苯二胺,加熱回流2小時,蒸餾,收集中間餾出液l00ml。再取0.lml餾出液按本操作方法測定不顯色即可使用。第七十四頁，共107頁。2022/11/2474

3.雜醇油(異戊醇、異丁醇)標(biāo)準(zhǔn)溶液---準(zhǔn)確稱取0.080g異戊醇和0.020g異丁醇加入預(yù)先裝有50ml無雜醇油乙醇的l00ml容量瓶中,再加水至刻度；此溶液每毫升相當(dāng)于1mg雜醇油,置低溫(dīwēn)保存。

4.雜醇油(異戊醇、異丁醇)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液---吸取雜醇油標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0ml于50ml容量瓶中,加水稀釋至刻度。此應(yīng)用液即為每毫升相當(dāng)于雜醇油0.10mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。第七十五頁，共107頁。2022/11/2475操作步驟1.將蒸餾酒稀釋10倍后再準(zhǔn)確吸取0.30ml置于10ml比色管中。

2.準(zhǔn)確吸取0、、、、、0.50ml雜醇油標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(相當(dāng)于0、、、、、0.05mg雜醇油)于10ml比色管中。

3.于樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管中準(zhǔn)確加水至1m1,搖勻。

4.各管放入冰浴中,沿管壁各加入2ml0.5%對二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液(róngyè),使其流至管底,再將各管同時搖勻。

5.各管同時放入沸水浴中加熱15min，取出,立即放入冰水中冷卻,并立即各加入2ml水,混勻,放置l0min。

6.以零管調(diào)零點，于520nm波長下測各管吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行定量。第七十六頁，共107頁。2022/11/2476第七十七頁，共107頁。2022/11/2477結(jié)果(jiēguǒ)計算式中：

X—樣品中雜醇油的含量，g/l00ml；

m—測定樣品管相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管的毫克數(shù)，mg；

V—樣品稀釋(xīshì)后的取樣體積，ml。國標(biāo)中規(guī)定(guīdìng)白酒中雜醇油（以異丁醇及異戊醇計）≤0.2g/100mL。第七十八頁，共107頁。2022/11/24785顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇2、在放入沸水中加熱時，要將比色管的蓋子打開。于50℃恒溫水浴中保溫，不時攪拌，使還原糖浸出。第八十頁，共107頁。酸度還影響有些顯色劑的顏色；酶活力單位(dānwèi)是表示酶活力大小的重要指標(biāo)。第九十七頁，共107頁。核酸％＝慢性中毒表現(xiàn)為粘膜刺激癥狀，昏睡、頭痛、消化障礙、視力模糊、耳鳴等，以致雙目失明。第二節(jié)應(yīng)用(yìngyòng)實例第八十五頁，共107頁。第九十三頁，共107頁。透射光與吸收光又可組成白光，這兩種光稱為互補(bǔ)色光。單糖(dāntánɡ)在含有多組分的體系中，若各組分對同一波長的光都有吸光作用，且各組分的吸光物質(zhì)彼此不發(fā)生作用，則測得的吸光度(guāngdù)等于各組分的吸光度(guāngdù)之和。非單色入射光引起的偏離注意事項1、在加入顯色劑時，要在冰水浴中進(jìn)行，并要沿管壁緩慢加入。2、在放入沸水中加熱時，要將比色管的蓋子打開。3、使用分光光度計時，要注意開蓋調(diào)“0”，盒蓋調(diào)“100”。并在使用前先進(jìn)行預(yù)熱。4、對二甲氨基苯甲醛-硫酸(liúsuān)顯色劑應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，放置時間最多不能超過2小時，該顯色劑應(yīng)沿管壁緩慢加入，否則會因溫度升得太快而影響顯色。第七十九頁，共107頁。2022/11/24794蛋白酶含量的檢測酶活力指酶催化某一特定反應(yīng)的能力。其大小可用在一定條件下酶催化反應(yīng)進(jìn)行一定時間后，反應(yīng)體系中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。酶活力單位(dānwèi)是表示酶活力大小的重要指標(biāo)。本實驗規(guī)定酶活力單位(dānwèi)(U)為一定條件下每分鐘生成1μg酪氨酸所需的酶量。第八十頁，共107頁。2022/11/2480實驗(shíyàn)原理

選用枯草桿菌蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的反應(yīng)體系。產(chǎn)物酪氨酸在堿性條件下與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，該藍(lán)色化合物在680nm處有最大光吸收，其吸光值與酪氨酸含量呈正比。通過測定一定條件下產(chǎn)物酪氨酸的含量變化(biànhuà)，可計算出蛋白酶的活力。第八十一頁，共107頁。2022/11/2481實驗(shíyàn)儀器和試劑儀器:恒溫(héngwēn)水浴鍋、分光光度計等?？莶輻U菌蛋白酶：稱取1g枯草桿菌蛋白酶粉，用少量，磷酸緩沖液溶解并定容至100mL，震蕩15分鐘，使充分溶解，干紗布過濾，取濾液冰箱備用。使用時視酶活力高低用緩沖液適當(dāng)稀釋。試劑

鹽酸溶液氫氧化鈉溶液

碳酸鈉溶液4.10%三氯乙酸溶液

5.標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液(50μg/mL)：稱取12.5mg以烘干至恒重的酪氨酸，用鹽酸約30mL溶解后，蒸餾水定容至250mL。

6.酪蛋白溶液(0.5%)：稱取1.25g酪蛋白，用氫氧化鈉溶液(20mL)溶解，再用磷酸緩沖液定容到250mL。第八十二頁，共107頁。2022/11/2482磷酸緩沖液：

稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2，用水定容至100mL(A液)；稱取磷酸二氫鈉(Na2HPO4.12H2，用水定容至100mL(B液)。取A液84mL，B液16mL混合后，得到磷酸緩沖液，可長期(chángqī)存放。臨用時稀釋10倍即可。8.Folin-酚試劑：

在2L磨口回流瓶中加入鎢酸鈉(Na2WoO4.2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2WoO4.2H2O)25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL以及濃鹽酸100mL，充分混勻后，微火回流加熱10小時。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL和液溴數(shù)滴，搖勻后開口繼續(xù)煮沸15min，以驅(qū)趕過剩的溴。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，過濾，溶液呈黃綠色，置于棕色試劑瓶中暗處貯藏。使用前用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液、酚酞為指示劑標(biāo)定酸度(約為2mol/L)，然后加水稀釋至1mol/L，即可使用。第八十三頁，共107頁。2022/11/2483實驗(shíyàn)流程酪蛋白調(diào)pH值、溫度，加入蛋白酶，反應(yīng)一定(yīdìng)時間酪氨酸比色測定(cèdìng)磷鉬藍(lán)磷鎢藍(lán)加入Folin-酚試劑顯色680nm比色計算酶活力操作步驟第八十四頁，共107頁。2022/11/2484(一)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支試管(標(biāo)號0、1-5)，按順序分別加入、、、、和1.00mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，再用水補(bǔ)足到，搖勻后各加入碳酸鈉，搖勻。依次加入Folin—酚試劑，搖勻于30℃水浴鍋中保溫15min。然后于680nm處測定(cèdìng)吸光值(以0號管作對照)。以酪氨酸含量(μg)作橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第八十五頁，共107頁。2022/11/2485(二)酶活力測定

1.酶反應(yīng)：取一支試管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中預(yù)熱5分鐘，再加入已預(yù)熱好的枯草桿菌蛋白酶液，立即計時，水浴中準(zhǔn)確保溫10min，從水浴中取出后，立即加入的10%三氯醋酸溶液，搖勻靜置數(shù)分鐘，干濾紙過濾，收集濾液(樣品(yàngpǐn)液)。另取一試管，先加入1.0mL已預(yù)熱好的枯草桿菌蛋白酶液和2.0mL的10%三氯醋酸溶液，搖勻，放置數(shù)分鐘，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保溫10min，同樣干濾紙過濾，收集濾液(對照液)。第八十六頁，共107頁。2022/11/24862.濾液中酪氨酸含量的測定

取3支試管(shìguǎn)，分別加入1.0mL水、樣品液、對照液，然后各加入碳酸鈉溶液和酚試劑，搖勻按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法保溫并測吸光度值。根據(jù)吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品液、對照液中酪氨酸含量差值，推算出酶的活力單位。第八十七頁，共107頁。2022/11/2487結(jié)果(jiēguǒ)處理1.酶活單位定義：在上述(shàngshù)條件下，酪蛋白水解1min產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位。2.計算其中：A樣品—樣品液的吸光度值

A對照—對照液的吸光度值

K—標(biāo)準(zhǔn)曲線上A=1時對應(yīng)的酪氨酸μg數(shù)

V—酶促反應(yīng)液的體積(本實驗為5mL)

T—酶促反應(yīng)時間(本實驗為10min)

N—酶溶液稀釋倍數(shù)第八十八頁，共107頁。2022/11/2488實驗(shíyàn)原理還原(huányuán)糖的測定是糖定量測定的基本方法。單糖(dāntánɡ)游離的醛基或酮基半縮醛羥基多糖？↙↘無還原性還原性部分寡糖5淀粉中還原糖含量的檢測第八十九頁，共107頁。2022/11/2489對沒有還原(huányuán)性的寡糖和多糖，可以利用酸水解法將其降解成具有還原(huányuán)性的單糖進(jìn)行測定，以求出樣品中總糖的含量（還原(huányuán)糖以葡萄糖含量計算）。第九十頁，共107頁。2022/11/2490在NaOH存在的條件下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈棕紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍(fànwéi)內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。黃色(huángsè)棕紅色第九十一頁，共107頁。2022/11/2491試劑(shìjì)和器材試劑標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)葡萄糖溶液3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑6mol∕LHCl6mol∕LNaOH材料山芋(shānyù)淀粉器材容量瓶，試管，移液管，量筒，水浴鍋，膠頭滴管，離心機(jī)，分光光度計等。第九十二頁，共107頁。2022/11/2492實驗(shíyàn)步驟1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線的制作取干凈試管6支，按表1進(jìn)行操作(cāozuò)。以吸光值為縱坐標(biāo)，各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號試劑012345標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液∕ml00.20.40.60.81.0蒸餾水∕ml1.00.80.60.40.20DNS試劑∕ml222222沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出，用自來水冷卻至室溫蒸餾水∕ml9.09.09.09.09.09.0葡萄糖含量∕mg00.20.40.60.81.0A540nm00.0510.1100.1500.2050.253第九十三頁，共107頁。2022/11/2493圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線經(jīng)分析(fēnxī)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：，相關(guān)系數(shù)R2。第九十四頁，共107頁。2022/11/24942.樣品中還原糖的提取(tíqǔ)與測定準(zhǔn)確稱取山芋淀粉，加蒸餾水約3ml，在研缽(yánbō)中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，并用約30ml的蒸餾水沖洗研缽(yánbō)2-3次，洗出液轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。于50℃恒溫水浴中保溫，不時攪拌，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉(zhuǎn)移到100ml離心管中，于4000r∕min下離心5min，沉淀用20ml蒸餾水洗一次，再離心，將兩次離心的上清液合并，用蒸餾水定容至100ml，混勻，作為還原糖待測液。取1ml進(jìn)行還原糖含量測定。A1

→C1

第九十五頁，共107頁。2022/11/24953.樣品中總糖的提取(tíqǔ)與測定準(zhǔn)確稱取山芋淀粉，加蒸餾水約3ml，在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶(shāopíng)中，并用約12ml的蒸餾水沖洗研缽2-3次，洗出液轉(zhuǎn)入三角燒瓶(shāopíng)中。再向燒瓶(shāopíng)中加入6mol/LHCl10ml，攪拌均勻后在沸水浴中水解，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解完畢，冷卻至室溫后以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈中性，并用蒸餾水定容至100ml，過濾，取濾液10ml于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液。取1ml總糖水解液，測定其還原糖含量。A2

→C2

第九十六頁，共107頁。2022/11/2496計算(jìsuàn)還原(huányuán)糖含量（mg∕g）=（c1×100）∕m總糖含量(hánliàng)（mg∕g）=（c2×1000）×0.9∕m式中：C-還原糖或總糖提取液的濃度，mg/ml；

V-還原糖或總糖提取液的總體積，ml；

m-樣品重量，g；乘以是為了從測定的總糖水解成單糖量中扣除水解時所消耗的水量。第九十七頁，共107頁。2022/11/24976紫外吸收法測定核酸(hésuān)含量實驗(shíyàn)原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（-C=C一C=C-），能夠強(qiáng)烈(qiánɡliè)吸收250-280nm波長的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260