1.1DNA重組技術(shù)的基本工具課標(biāo)定位1.簡(jiǎn)述DNA重組技術(shù)所需的基本工具及其作用。2.認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。課前自主學(xué)案基礎(chǔ)梳理二、DNA重組技術(shù)的操作工具1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”（1）主要來(lái)源：______生物。（2）特點(diǎn)：能夠識(shí)別DNA特定的__________，切開(kāi)兩個(gè)核苷酸之間的___________。（3）DNA末端：限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式為_(kāi)_______和______。原核核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端平末端2.DNA連接酶——“分子縫合針”（1）作用：將雙鏈DNA片段縫合起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的___________。（2）種類①E.coliDNA連接酶：只能縫合雙鍵DNA的_________。②T4DNA連接酶：既可縫合雙鍵DNA的黏性末端，又可縫合雙鏈DNA的_______。磷酸二酯鍵黏性末端平末端3基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”（1）載體的種類①質(zhì)粒：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有________能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。②λ噬菌體的衍生物。③動(dòng)植物病毒。自我復(fù)制（2）質(zhì)粒載體的特點(diǎn)①能夠在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。②具有一個(gè)或多個(gè)______________，便于供外源DNA插入。③具有特殊的_________，供重組DNA的鑒定和選擇。（3）質(zhì)粒載體的處理：真正用作載體的質(zhì)粒，都必須在細(xì)胞外經(jīng)人工改造。限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因解析：選B。此題主要考查限制酶的有關(guān)知識(shí)。限制酶能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)；DNA分子經(jīng)限制酶切割會(huì)形成黏性末端和平末端兩種形式。解析：選B。解析：選D。DNA重組技術(shù)中，兩個(gè)DNA片段間必須有相同的黏性末端才能互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行結(jié)合；具有相同黏性末端的DNA分子連接時(shí)，DNA連接酶的作用是催化脫氧核苷酸鏈的脫氧核糖與磷酸間的磷酸二酯鍵的形成，即把“梯子”的扶手縫合起來(lái)。解答此類題目時(shí)，應(yīng)注意理解DNA連接酶的作用部位以及與DNA聚合酶的區(qū)別。DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)脫氧核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的DNA片段的末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵。4.質(zhì)粒之所以能做基因工程的載體，是由于它（）A.含蛋白質(zhì)，從而能完成生命活動(dòng)B.能夠自我復(fù)制，且能保持連續(xù)性C.是RNA，能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成D.具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠攜帶目的基因解析：選B。解答本類試題的重點(diǎn)是理解基因工程中載體的特點(diǎn)。5.下圖為一種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子的示意圖。請(qǐng)回答問(wèn)題：（1）這種限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)是________，形成_______個(gè)______末端，特點(diǎn)是_________________________________。（2）從題干中可知限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的特點(diǎn)是_______________________________________。（3）如果G發(fā)生突變，可能發(fā)生_________________。解析：由題意知該限制酶識(shí)別的核苷酸序列是GAAT-TC，專一切口是G和A之間。切出的兩個(gè)黏性末端是G和AATTC,兩個(gè)黏性末端的CTTAAG關(guān)系是堿基互補(bǔ)配對(duì)。答案：（1）G與A之間2黏性堿基互補(bǔ)配對(duì)（2）只能識(shí)別某一種特定的核苷酸序列（3）限制性核酸內(nèi)切酶不能識(shí)別切割位點(diǎn)要點(diǎn)二和DNA有關(guān)的幾種酶1.幾種酶的比較2.上述四種酶的作用部位限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶作用于①部位，DNA解旋酶作用于②部位?！咎貏e提醒】由于核苷酸分子間的氫鍵是分子間作用力，其斷裂與重新形成均與限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶無(wú)關(guān)。2.遺傳標(biāo)記基因：質(zhì)粒上有一些特殊的基因，如抗四環(huán)素基因、抗氨芐青霉素基因，用于對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇。3.作為載體的條件（1）能自我復(fù)制；（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；（3）有特殊的標(biāo)記基因；（4）對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害等。主要起到切割外源DNA，使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2.DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？（教材P6）答案：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種，一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coliDNA連接酶；另一種是從T4DNA噬菌體中分離得到的，稱為T(mén)4DNA連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），二者的差別主要表現(xiàn)在：（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此，DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同?！九詸谒伎肌肯胍幌耄邆涫裁礂l件才能充當(dāng)“分子運(yùn)輸車”？（教材P6）答案：能自我復(fù)制，有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)，有標(biāo)記基因位點(diǎn)及對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害等?！窘馕觥勘绢}主要是考查基因工程中有關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用，一般來(lái)說(shuō)一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割位點(diǎn)切割DNA，雖然限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ與限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ識(shí)別的堿基序列不同，但切割后形成的黏性末端是可以互補(bǔ)的，或者說(shuō)兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的黏性末端是相同的，因此在DNA連接酶的作用下可以將這兩種酶切割后形成的黏性末端連接起來(lái)?！敬鸢浮浚?）（2）（3）能。因?yàn)樯鲜鰞煞N不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的?！練w納總結(jié)】限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)（1）限制性核酸內(nèi)切酶所識(shí)別的DNA序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4、5、8個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。（2）若限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別序列的中心軸線的兩側(cè)分別切割，則得到黏性末端，若限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別序列的中心軸線處進(jìn)行切割，則得到平末端。例2通過(guò)DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)，下圖表示了這一技術(shù)的基本過(guò)程，在該工程中所用的基因“剪刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，請(qǐng)回答：（1）從羊染色體中“剪下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是__________。人體蛋白質(zhì)基因“插入”羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶是__________。（2）請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過(guò)程圖。（3）人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是__________?！窘馕觥勘绢}考查基因工程的基本操作，在基因工程中用到的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，在對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切割的時(shí)候，一定要用同一種限制性核酸內(nèi)切酶，才能切出相同的黏性末端，當(dāng)插入目的基因時(shí)，常用DNA連接酶把二者之間形成磷酸二酯鍵連上?！敬鸢浮浚?）限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶（2）—CCTAG↑G—用限制性核酸內(nèi)切酶切割—GGATCC——CCTAGG—（3）人的遺傳物質(zhì)（基因）與羊的都為DNA，其物質(zhì)組成和空間結(jié)構(gòu)相同【易誤警示】限制酶與DNA連接酶的關(guān)系隨堂即時(shí)檢測(cè)課后反思淘金1.基因工程是在不同物種之間轉(zhuǎn)移基因，克服了物種間存在的生殖隔離，創(chuàng)造了前所未有的生物新類型。如大腸桿菌生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素，大腸桿菌生