第三章鼠源單克隆抗體廖振林概述在過去的二十五年里,利用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)了成千上萬的鼠單克隆抗體.人們用同樣的技術(shù)從轉(zhuǎn)基因鼠中克隆人類的抗體，并設(shè)計(jì)了全長型抗體和重組片段,它們可以被用于多種診斷和治療。而且如果他們能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞,牛奶及植物中表達(dá),就可以大量獲得.一個(gè)世紀(jì)以前,PaulEhrlich提出了著名的側(cè)鏈理論來解釋抗原抗體的相互作用.他不久又鑄造了一個(gè)虛構(gòu)的短語”魔彈”來形容抗體對準(zhǔn)及中和抗原.七十五年以后

GeorgesK?hlerandCésarMilstein發(fā)明了單克隆抗體技術(shù),因此為細(xì)胞生物學(xué)和臨床診斷學(xué)的巨大進(jìn)步鋪平了道路.廖振林食品學(xué)院鼠和人的單克隆抗體

抗體分泌雜交瘤是由生長是不確定的骨髓瘤細(xì)胞得到的。一些不能分泌的骨髓瘤細(xì)胞系缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)化酶(HGPRT),被確定作為融合配偶。為了選擇成功的融合細(xì)胞,細(xì)胞須在一個(gè)含有次黃嘌呤,氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的介質(zhì)中培養(yǎng),這樣只有融合細(xì)胞可以增生。噬菌體的發(fā)展加強(qiáng)了抗體庫的篩選,從而為獲得人類單克隆抗體提供了新的手段..廖振林食品學(xué)院轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的人抗體

免疫后的轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生功能上很重要的高親和力的人抗體。通過普通的雜交瘤技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)克隆和生產(chǎn)。

鼠體內(nèi)的人抗體和人細(xì)胞產(chǎn)生的人抗體可以通過他們糖基化的狀態(tài)加以區(qū)別。預(yù)期的結(jié)果在最初的實(shí)驗(yàn)中達(dá)到了，該實(shí)驗(yàn)利用含人抗體的小鼠和由鼠分離的雜交瘤細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系得到人抗體。廖振林食品學(xué)院抗體片段的重組

由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的Fv片段，是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小免疫球蛋白片段。然而，F(xiàn)vs的兩條鏈的結(jié)合力比Fab段的要低，F(xiàn)ab段也是由CH1和CL的不變區(qū)組成的。VH和VL之間是由肽段連接的，二硫鍵和“節(jié)和孔突變”可以加固他們的連接。

廖振林食品學(xué)院單鏈Fv片段

scFv在非靶組織中滯留時(shí)間較短，在血液中清除速度較快且更易侵入腫塊。它有較低的免疫原性，并較易和蛋白質(zhì)及肽結(jié)合。單一抗體片段

它和輕鏈可變區(qū)相互作用的粘連的碎片影響了他們的溶解度和穩(wěn)定性。它和抗原的親和力較低而且和不相干的抗原有交叉反應(yīng)的趨勢。構(gòu)建多價(jià)體Fv抗體為了增加單價(jià)體scFv的親和性，可以強(qiáng)制縮合肽段使它們形成多聚體。

廖振林食品學(xué)院產(chǎn)生系統(tǒng)

細(xì)菌,酵母菌,植物,昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗體和抗體片段的產(chǎn)物都有它的表達(dá)系統(tǒng).細(xì)菌：不能裝配所有糖基化的抗體,但是可以裝配抗體片段的產(chǎn)物.酵母菌：可以表達(dá)完整的抗體,但含有高的甘露糖和多分支的寡糖,而且在效應(yīng)器功能方面有缺陷。攜帶桿狀病毒群的昆蟲細(xì)胞植物：它們的抗體都含有碳水化合物,但結(jié)構(gòu)上和哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的不同.骨髓瘤細(xì)胞和哺乳動(dòng)物非淋巴樣細(xì)胞：都可以表達(dá)全功能抗體。廖振林食品學(xué)院含抗體的奶為了使哺乳動(dòng)物的乳腺產(chǎn)生乳蛋白以外的其它蛋白質(zhì),可以從超排卵供體的輸卵管微量注射數(shù)百個(gè)復(fù)制體到受精卵而引入胚系序列,使外來基因和DNA融合,這些基因編碼乳房特殊調(diào)節(jié)序列.經(jīng)過一段時(shí)間的離體培養(yǎng),可以把胚胎轉(zhuǎn)移到假孕動(dòng)物的輸卵管或子宮,并發(fā)育到產(chǎn)期.最初的奶純化階段使用普通的操作，也就是移去酪蛋白和脂肪。澄清的乳清包含高濃度的相關(guān)抗體，它可以通過離子交換和親和層析來純化。純化的抗體和從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中得到的抗體沒有區(qū)別。廖振林食品學(xué)院小結(jié)從雜交瘤細(xì)胞得到的鼠單克隆抗體提供了生物學(xué)臨床研究和診斷的重要工具。僅人類基因組工程預(yù)期能定義大約100，000個(gè)編碼同等數(shù)量蛋白質(zhì)的功能基因。最激動(dòng)人心的發(fā)展之一是人單克隆抗體的治療上的應(yīng)用，它比鼠抗體更有效和安全。Ehrlich的最早的關(guān)于“魔彈”的預(yù)言將會(huì)被實(shí)現(xiàn)。廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院動(dòng)畫廖振林食品學(xué)院基本概念抗原決定鏃（抗原表位）細(xì)胞克隆多克隆抗體單克隆抗體廖振林食品學(xué)院Antigenicdeterminant是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).廖振林食品學(xué)院Polyclonalantibody,PcAb：針對多種抗原決定簇的混合抗體Monoclonalantibody,McAb:由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體廖振林食品學(xué)院雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克隆化，制備McAb廖振林食品學(xué)院細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）廖振林食品學(xué)院甲氨蝶呤（aminopterin）甲氨蝶呤是一種葉酸拮抗劑，可阻斷DNA合成的主要途徑，這樣DNA的合成需要補(bǔ)救途徑來完成。該途徑需要次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶脫氧核苷（T）等前體存在。而且細(xì)胞內(nèi)要有次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）存在。若缺乏其中一種酶，該補(bǔ)救途徑便不能發(fā)揮作用。廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院

抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞（B細(xì)胞）（B細(xì)胞惡性腫瘤）1.抗體分泌（Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生長2.8-AG篩選出

HGPRT-株

PEG融合HAT篩選

脾-骨髓瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）

（HGPRT+、Ig+）

8-AG8：雜氮鳥嘌呤廖振林食品學(xué)院融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞廖振林食品學(xué)院制備單克隆抗體的基本技術(shù)1抗原提純與動(dòng)物免疫2骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備3細(xì)胞融合4抗體檢測5雜交瘤的克隆化和凍存6McAb的制備7單克隆抗體的純化廖振林食品學(xué)院免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞，此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高?？扇苄钥乖?0-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）選用6-12周齡Balb/c小鼠廖振林食品學(xué)院顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。

廖振林食品學(xué)院骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)：穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥嘌呤）防止支原體污染（胎牛血清）融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％融合比例脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞=3：1許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞一般在融合前一天制備廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院免疫脾細(xì)胞：處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天后的脾臟。融合比例：骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1：5或1：10融合劑：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小時(shí)后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周后改用一般培養(yǎng)液廖振林食品學(xué)院一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí)，開始檢測特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系。可靠的篩選方法須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)。廖振林食品學(xué)院克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，防染色體丟失、變異及污染廖振林食品學(xué)院有限稀釋法從陽性分泌孔中收集雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過逐步稀釋，使每孔只有一個(gè)細(xì)胞。廖振林食品學(xué)院單克隆抗體制備具體步驟

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院廖振林食品學(xué)院一、抗原與動(dòng)物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。廖振林食品學(xué)院

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。廖振林食品學(xué)院

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7廖振林食品學(xué)院可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。廖振林食品學(xué)院資料：佐劑對可溶性抗原而言，為了增強(qiáng)其免疫原性或改變免疫反應(yīng)的類型、節(jié)約抗原等目的，常采用加佐劑的方法以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

1．佐劑的類型目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑有氫氧化鋁膠、明礬、弗氏佐劑、脂質(zhì)體和石蠟油等。也有采用結(jié)合桿菌等分枝桿菌、白喉?xiàng)U菌以及細(xì)小棒狀桿菌等。⑴弗氏不完全佐劑（incompleteFreund'sadjuvant,IFA）羊毛脂1份石蠟油5份混合，高壓滅菌后保存。用時(shí)加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進(jìn)行乳化處理。⑵弗氏完全佐劑（completeFreund'sadjuvant,CFA）弗氏不完全佐劑10ml

卡介苗10mg～200mg

卡介苗可100℃10min滅活處理。廖振林食品學(xué)院初次免疫時(shí)，最好用弗氏完全佐劑，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。再次免疫時(shí)，一般不用完全佐劑，而采用弗氏不完全佐劑。但在研究分枝桿菌及相關(guān)抗原時(shí)，一般不用弗氏完全佐劑，以免卡介苗的干擾。⑶脂質(zhì)體：是人工制備的類脂質(zhì)的小球體，由一個(gè)或多個(gè)酷似細(xì)胞膜的類脂雙分子層組成，這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性物質(zhì)，他們被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部的水相中，或插入類脂雙分子層或吸附、聯(lián)接在脂質(zhì)體的表面，起到明顯的免疫增強(qiáng)作用。⑷油佐劑：采用植物油和礦物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前應(yīng)用最廣的礦物油。10號(hào)白油(石蠟油)100ml硬脂酸鋁2g司本806ml

混合加熱融化，分裝。用時(shí)按下列配方進(jìn)行乳化。油相3份水相（加4%吐溫－80）1份先把油相攪拌起來，然后緩慢加入水相乳化。司本是油分散劑，吐溫是水分散劑，均有利于乳化。廖振林食品學(xué)院佐劑概念1.概念:即將其預(yù)先或與抗原一起注射給機(jī)體可增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變應(yīng)答的類型的物質(zhì)2.分類:

無機(jī)佐劑與有機(jī)佐劑.3.作用機(jī)制:①改變抗原物理性狀，延長抗原在體內(nèi)存留時(shí)間，②刺激吞嗜細(xì)胞，增強(qiáng)提呈能力，③刺激淋巴細(xì)胞增殖，分化廖振林食品學(xué)院脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg。

廖振林食品學(xué)院體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點(diǎn)：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。廖振林食品學(xué)院體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o2o廖振林食品學(xué)院二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的方法：脾細(xì)胞（1×10）骨髓瘤細(xì)胞（2×10）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。87廖振林食品學(xué)院

用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)，長期穩(wěn)定。

PEG相對分子量4000，濃度為50%

二甲基亞砜增加融合率。廖振林食品學(xué)院細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞。選擇性培養(yǎng):

培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻斷DNA合成。廖振林食品學(xué)院三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等?？寺』侵竼蝹€(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。廖振林食品學(xué)院單抗生產(chǎn)的方法：動(dòng)物體內(nèi)誘生法：小鼠腹腔注射降植丸或液體石蠟，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后出現(xiàn)腹水，無菌采集。廖振林食品學(xué)院單抗純化方法：鹽析凝膠過濾離子交換層析親和層析法辛酸沉淀法廖振林食品學(xué)院用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白廖振林食品學(xué)院凝膠過濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)廖振林