將某載體上的水稻DNA片段亞克隆到另一載體上第一部分：分子克隆技術(shù)pUC19pU1301+1.5KB外源雙酶切：

BamHI+KpnI兩種載體的抽提瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量?jī)煞N載體的限制性內(nèi)切酶消化目的片段的回收及亞克隆載體的去磷酸化載體與外源DNA的連接感受態(tài)細(xì)胞的制備連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞重組子篩選及鑒定亞克隆的主要步驟質(zhì)粒載體的提取是一個(gè)復(fù)制子，載體在受體細(xì)胞中能大量繁殖，其攜帶的外源基因才能在受體細(xì)胞中得到大量擴(kuò)增有1到多個(gè)限制內(nèi)切酶的單一識(shí)別與切割位點(diǎn)，便于外源基因的插入具有選擇性的遺傳標(biāo)記(如抗生素抗性標(biāo)記等)以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，并據(jù)此標(biāo)記將攜帶載體的細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離出來載體必備條件雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它所攜帶的遺傳信息。它可獨(dú)立游離于細(xì)胞質(zhì)中，也可整合到細(xì)菌染色體上。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可分為嚴(yán)謹(jǐn)型（只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1至幾個(gè)拷貝）和松弛型（細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，拷貝數(shù)較多，一般在細(xì)胞內(nèi)有20個(gè)以上）質(zhì)粒的基本特點(diǎn)SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） 50mM EDTA 10mM RNaseA 100μg/mlSolutionII:NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAC1.32M UsingHACtoadjustpHto4.8TE(pH8.0)：Tris.HCl（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0）

1mM苯酚/氯仿無水乙醇或異丙醇

堿裂解法用到的試劑SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，堿基還未來得及配對(duì)就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量的RNA等纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對(duì)重新形成超螺旋，處于溶解狀態(tài)。試劑的作用（二）試劑的作用（三）苯酚/氯仿：純化質(zhì)粒，去除質(zhì)粒溶液中殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；無水乙醇或95%乙醇或異丙醇：沉淀質(zhì)粒DNATE或H2O：溶解質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)材料攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌菌液。操作步驟取含有相應(yīng)載體的大腸桿菌菌液于含有相應(yīng)抗生素的LA培養(yǎng)基上涂布或劃線分離單菌落，37℃過夜培養(yǎng)）；用無菌牙簽或接種環(huán)挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250r/min過夜培養(yǎng)吸取1.5ml菌液，12000g離心2鐘，收集菌體，倒掉上清；再次吸取1.5ml菌液收集菌體，盡量將菌液倒干凈；加入300l溶液I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）；加入300l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘（最好不超過2分鐘）；

加入300l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；氨芐青霉素（ampicillin）：其主要是通過阻礙細(xì)胞壁的合成最終導(dǎo)致細(xì)胞的裂解。氨芐青霉素抗性基因（ampr）：合成β-內(nèi)酰胺酶，在氨芐青霉素進(jìn)入細(xì)胞之前將其水解(使用濃度100μg/ml)卡那霉素（Kanamycinsulfate）

：核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成（使用濃度：50μg/ml)RNaseA:

C或U的3’－P與相鄰的5’－OH處切開RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分鐘，分裝成小份儲(chǔ)存于－20℃。試驗(yàn)中用到的抗生素和酶DNA純度：吸光值檢測(cè)：檢測(cè)260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計(jì)A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有RNA。質(zhì)量檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳：一般有一至三條帶（超螺旋、線型、開環(huán)三種構(gòu)型），點(diǎn)樣孔附近無DNA帶（無染色體DNA污染）。質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測(cè)DNA的瓊脂糖凝膠電泳

帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。

影響DNA遷移速率的因素

DNA分子大小：遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。瓊脂糖濃度：logU=logU0-Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>開環(huán)；當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm堿基組成與溫度：4-30℃一般影響不大嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度：影響DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×或1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）實(shí)驗(yàn)步驟：將洗凈、干燥的制膠板放入制膠槽中，水平放置在工作臺(tái)上；配制0.8%的瓊脂糖凝膠：稱取0.24g瓊脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r(shí)倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenolblue,Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔中2.含有電泳指示劑，以指示電泳的進(jìn)程上樣緩沖液：EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測(cè)DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。1000×貯存液(0.5mg/mL)，使用時(shí)按1：1000稀釋配制染色液。質(zhì)粒電泳檢測(cè)：一般有一至三條帶（質(zhì)粒DNA的三種構(gòu)型）超螺旋線型開環(huán)質(zhì)粒電泳檢測(cè)本科生試驗(yàn)圖片質(zhì)粒載體的抽提，外源DNA的準(zhǔn)備瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量亞克隆載體與外源DNA的限制性內(nèi)切酶消化(目的片段的回收，亞克隆載體的去磷酸化)載體與外源DNA的連接感受態(tài)細(xì)胞的制備連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞重組子的轉(zhuǎn)化及篩選、鑒定利用質(zhì)?？寺⊥庠碊NA片段的主要步驟外源DNA克隆的要求特點(diǎn)不同的突出端用兩種限制酶消化后需純化質(zhì)粒以提高連接效率一般酶切位點(diǎn)可保留,非重組克隆背景低不需CIP處理外源DNA只以一個(gè)方向插入重組質(zhì)粒中相同的突出端線狀質(zhì)粒DNA常需用磷酸酶（CIP）處理一般酶切位點(diǎn)?？杀Ａ敉庠碊NA會(huì)以兩個(gè)方向插入重組質(zhì)?？蓭в型庠碊NA的串聯(lián)拷貝末端為平端要求較高的DNA及連接酶不同酶切的平頭可連接非重組克隆的背景高質(zhì)粒及外源DNA連接處的酶切位點(diǎn)消失（不同平端酶）重組質(zhì)粒可能帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝載體及外源片段的限制酶消化:限制性內(nèi)切酶切出相互匹配的粘性末端（一種酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；載體的去磷酸化:堿性磷酸酶去除載體的5’－P基團(tuán)，以防載體自連；線狀載體與外源片段的連接:連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價(jià)鍵，若質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團(tuán)，則可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個(gè)雜交分子帶有2個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。限制性內(nèi)切酶堿性磷酸酶連接酶幾種工具酶有特定的識(shí)別序列，通常為4－6堿基的回文對(duì)稱序列。切割位點(diǎn)位于識(shí)別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基團(tuán)，3’末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2＋作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)限制酶的一個(gè)活性單位（1U）：原則上指在50μl反應(yīng)體系中，37℃下，經(jīng)過1小時(shí)的反應(yīng)將1μg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下使用時(shí)對(duì)底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識(shí)別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。高濃度的甘油（>5％）；酶過量（>100U/ug）；低離子強(qiáng)度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有機(jī)溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價(jià)陽離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對(duì)上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：BamHI：

G▼GATTC CCTAA▲GKpnI: GGTAC▼C C▲CATGG含外源DNA片段的載體(M812)（50l反應(yīng)體系，用1.5mltube，冰上操作）

質(zhì)粒DNA

30lBamHI(10u/μl) 1lKpnI(10u/μl)

1l

10×buffer 5lddH2O 13l分別取5l酶切產(chǎn)物用0.8％－1.2%凝膠檢測(cè)酶切效果

50

lTotal目的載體（Puc19)的限制性內(nèi)切酶消化電泳檢測(cè)MarkerpUC19質(zhì)粒對(duì)照pUC19質(zhì)粒酶切產(chǎn)物M812質(zhì)粒對(duì)照M812質(zhì)粒酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣順序：2011本科生酶切圖片

lane1-4,pUC19酶切產(chǎn)物L(fēng)ane5,pUC19質(zhì)粒Lane6，M812質(zhì)粒Lane7-10,M812酶切產(chǎn)物L(fēng)ane11,DL-2000

marker,1

11造成DNA酶切不完全的主要原因有：DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；操作不當(dāng)，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；反應(yīng)條件不合適，用錯(cuò)了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA樣品中的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/μgDNA)增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間消化基因組DNA時(shí)，加入終濃度1-2.5mmol/L多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)合帶負(fù)電荷的污染物。純化DNA酶切反應(yīng)的終止加入終農(nóng)度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(yīng)多數(shù)酶在65°C10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65°C不失活的酶在75°C15分鐘也能失活若酶對(duì)熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化pUC19酶切產(chǎn)物的純化：加入ddH2O150l（擴(kuò)大體積），加入200μl氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于10lddH2O；

氯仿對(duì)眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時(shí)需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)齻?。操作時(shí)應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。注意當(dāng)一個(gè)體系中有多種DNA分子，而我們只需要其中的某種DNA時(shí)或者反應(yīng)體系中含有目的DNA子以外的其它分子如各種工具酶、dNTPs、引物及礦物油等時(shí)，可以利用凝膠電泳分離各種DNA，然后挖膠回收目的DNA帶?；厥辗椒ㄖ饕校?/p>

1.低熔點(diǎn)瓊脂糖

2.透析帶電洗脫法

3.glassmilk純化

4.柱回收試劑盒DNA的回收純化：柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟：1.通過瓊脂糖凝膠將目的DNA帶與載體帶分開；2.紫外燈下用干凈的刀片切下含目的DNA帶的膠塊放入1.5ml離心管中；（注意：不含DNA的膠盡可能切除，在長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外燈下切膠，并盡量縮短DNA暴露在紫外光下的時(shí)間）3.按400μl/100mg膠的比例加入BindingBufferII,50-60oC水浴中10分鐘，使膠融化，每2-3分鐘混勻一次；（注意若膠的濃度較大需增加BindingBufferII的比例、增加融膠的時(shí)間，若膠塊體積較大也需增加融膠的時(shí)間）4.將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘；5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管內(nèi)，加入500μlWashSolution,8000rpm室溫離心1分鐘；6.重復(fù)5步一次，7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管內(nèi)，12000rpm室溫離心15秒；8.將UNIQ-10柱放入一個(gè)新的1.5ml離心管內(nèi)，在柱子膜中央加40μlElutionBuffer或水（pH>7.0），室溫或37oC放置2分鐘；（提高洗脫溫度到55oC-80oC有利于提高DNA的洗脫效率）9.12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的溶液即為回收的DNA片段注意1.首次使用前，必須在WashSolution中加入4倍體積的無水乙醇，充分搖勻后使用，每次使用后將瓶蓋擰緊，以保持WashSolution中的乙醇含量。2.ElutionBuffer為2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4oC保存。也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。載體去磷酸化細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）,牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）以及小蝦堿性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸單脂鍵的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基），不能催化磷酸三脂的水解。比較而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP經(jīng)加熱處理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不論是BAP還是CIAP還需要經(jīng)苯酚處理。而SAP經(jīng)65?C加熱15分鐘就可完全失活。活性定義：在37?C、pH9.8的條件下，1分鐘內(nèi)水解對(duì)硝基苯磷酸鹽（ρ-nitrophenylphosphate)生成1μM的對(duì)硝基苯(ρ-nitrophenol)所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）.堿性磷酸酶載體去磷酸化反應(yīng)體系：DNA 20lCIAP（TaKaRa） 0.5l10buffer 4.0lddH2O 15.5l37℃

或50℃反應(yīng)30min以上

Total40l去磷酸化載體的純化加0.4l0.5M的EDTA（終濃度5mM)，75℃水浴10min,使CIAP失活；加入ddH2O150l（擴(kuò)大體積），加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）載體與外源DNA片段的連接連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價(jià)鍵，若質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團(tuán)，則可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個(gè)雜交分子帶有2個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。大腸桿菌連接酶T4噬菌體連接酶。連接酶各種連接酶特性的比較：T4DNALigase

E.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最適pH輔酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少數(shù)可能不能可能NO外源DNA 4l目的載體DNA 4l10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l

連接反應(yīng)體系：16oC水浴保溫過夜Total10l感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

感受態(tài)細(xì)胞的制備體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，因此需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌主要有兩種方法：CaCl2法：利用冰冷的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。106～107轉(zhuǎn)化子/gDNA。電轉(zhuǎn)化法：利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔。因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。109～1010轉(zhuǎn)化子/gDNA；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。操作注意事項(xiàng)前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時(shí)）；取1ml過夜培養(yǎng)物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)（300rpm）；將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入20l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸?。患?xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),48小時(shí)內(nèi)使用，可以暫時(shí)保存在4℃.長(zhǎng)時(shí)間保存，需添加冷凍保護(hù)劑（15%～20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）操作注意事項(xiàng)

密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè)OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml）；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化步驟

制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250mlLA培養(yǎng)基中250lAmp，250lX-gal，25lIPTG，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；取出3管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3管感受態(tài)細(xì)胞分別加DNA連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒DNA（陽性對(duì)照）及不加入任何DNA（陰性對(duì)照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；復(fù)蘇：每管加400lSOC培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動(dòng)溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時(shí)

即可觀察到藍(lán)白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）注意：利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過105個(gè)菌落），同時(shí)37℃培養(yǎng)不應(yīng)超過20小時(shí)，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時(shí)）；取1ml過夜培養(yǎng)物于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)（300rpm）；將菌液迅速置于冰上，同時(shí)10%的甘油置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）棄去上清，加入1500l預(yù)冷的10％的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；棄去上清，加入750l預(yù)冷預(yù)冷的10％的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；棄去上清，加入20l預(yù)冷預(yù)冷的10％的甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。使用的培養(yǎng)基最好用NaCl減半的LB培養(yǎng)基；密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè)OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml）；制備感受態(tài)細(xì)胞及配制試劑所用的水應(yīng)達(dá)到18MΩ,即使用超純水；化學(xué)試劑應(yīng)是分子生物學(xué)級(jí)；所使用的槍頭和器皿都應(yīng)是新的，干凈無菌的；無菌操作；低溫（冰上）進(jìn)行。操作注意事項(xiàng)——特別控制鹽離子的殘留影響電轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀