iTRAQ技術(shù)對(duì)卵巢癌早期篩查/診斷的蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究

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卵巢癌的研究現(xiàn)狀

目前最普遍使用的卵巢癌生物標(biāo)記物是腫瘤抗原CA125,盡管80%的晚期卵巢癌病人CA125濃度不正常,但是50%～60%的Ⅰ期卵巢癌病人CA125濃度增高。CA125作為標(biāo)記物的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不到10%。因此,需要尋找特異性更強(qiáng)和靈敏度更高的腫瘤分子標(biāo)記物。

蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展盡管人類基因組包含了機(jī)體的所有遺傳信息,但其只是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，而構(gòu)成細(xì)胞并發(fā)揮各種功能作用則是由蛋白質(zhì)來(lái)完成，蛋白質(zhì)還是機(jī)體多種不同類型細(xì)胞之間差異的決定因素。同樣,腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)組的不同來(lái)決定的。因此，有必要從蛋白質(zhì)組水平來(lái)揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)可全面、動(dòng)態(tài)、定量地分析比較正常與癌變標(biāo)本中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變,不僅有助于腫瘤發(fā)病機(jī)制的闡明,還能篩選和鑒定蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記和特異性抗原,在腫瘤的早期診斷、治療和新藥研制方面,具有廣闊的應(yīng)用前景。研究背景第2頁(yè)，共14頁(yè)。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。磷酸化的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致很多嚴(yán)重的人類疾病，如癌癥。磷酸化蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)用于卵巢癌研究中，有利于尋找卵巢癌診斷和治療的靶點(diǎn)。目前，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在定量研究方面多采用32P代謝標(biāo)記、熒光染料染色的磷酸化蛋白質(zhì)定量分析方法、同位素標(biāo)記技術(shù)等。對(duì)于圖譜創(chuàng)建中許多磷酸化調(diào)控蛋白呈低豐度狀況,蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)敏感性的提高將是克服這一障礙的關(guān)鍵。隨著樣本制備技術(shù)和儀器設(shè)備的迅速發(fā)展,更好的富集策略和磷酸化定量?jī)纱箅y點(diǎn)將會(huì)不斷得到克服,蛋白磷酸化位點(diǎn)的鑒定和定位技術(shù)也更易開展

穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在定量準(zhǔn)確度和規(guī)?；糠治龇矫娑加泻艽蟮膽?yīng)用前景。這種方法既可以研究全蛋白質(zhì)組的變化,也可以結(jié)合磷酸化肽段的富集技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技術(shù)同樣可用于磷酸化肽段的研究。研究背景第3頁(yè)，共14頁(yè)。研究背景我們?yōu)槭裁催x擇iTRAQ技術(shù)？

iTRAQ技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可同時(shí)對(duì)多種樣品進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量研究的方法，可以標(biāo)記生物樣品中產(chǎn)生的所有肽段，增強(qiáng)任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時(shí)保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結(jié)構(gòu)信息，可以實(shí)現(xiàn)在二級(jí)圖譜上的定量，具體原理已有詳細(xì)報(bào)道，但目前有關(guān)iTRAQ在磷酸化蛋白質(zhì)定量方面的研究報(bào)道還很少。這種方法是建立在iTRAQ試劑的基礎(chǔ)上。iTRAQ實(shí)際上是一種同位素標(biāo)記試劑包括一個(gè)帶電荷的報(bào)告基團(tuán)，另外還有一個(gè)肽段反應(yīng)基團(tuán)和一個(gè)平衡基團(tuán)。第4頁(yè)，共14頁(yè)。主要觀點(diǎn)和創(chuàng)新之處目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于卵巢癌的早期篩查/診斷尚缺乏有效方法和特異性的腫瘤標(biāo)志物。我們本次實(shí)驗(yàn)意在通過(guò)對(duì)卵巢癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，或得出正常卵巢和癌變卵巢表達(dá)蛋白的差異。

基于iTRAQ+蛋白組學(xué)研究+蛋白磷酸化修飾的差異基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選卵巢癌血清標(biāo)記物在國(guó)內(nèi)雖有學(xué)者研究，但還沒(méi)有突破性的成果。我們發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)學(xué)者研究卵巢癌表達(dá)蛋白磷酸化修飾的差異，我們此次通過(guò)研究卵巢癌表達(dá)蛋白磷酸化修飾的差異或得出正常卵巢和癌變卵巢表達(dá)蛋白的磷酸化修飾是否存在差異。從而尋找用于卵巢癌早期診斷的血清腫瘤標(biāo)志物提供了一定的臨床前期研究基礎(chǔ)。之所以選擇磷酸化修飾作為研究對(duì)象，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)磷酸化是最常見，也是最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)的磷酸化在真核生物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有很重要的作用。第5頁(yè)，共14頁(yè)?；舅悸泛头椒P(guān)注新浪微博jdpptor@經(jīng)典PPT第6頁(yè)，共14頁(yè)?；舅悸泛头椒?、血清來(lái)源:

選取醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為卵巢惡性腫瘤患者晨空腹血清20份，年齡33～70歲，設(shè)為卵巢癌組；經(jīng)體檢無(wú)任何疾病的健康人群晨空腹血清20份，設(shè)為正常對(duì)照組。所采集的血清標(biāo)本保存于-80℃冰箱；第7頁(yè)，共14頁(yè)?；舅悸泛头椒?、血清差異蛋白篩選：1）去除高豐度蛋白：每組樣品先取10例冰上解凍。等體積混合得到混合血清。從中取20μL，用緩沖液A各稀釋4倍。加入0.22μm的離心過(guò)濾器4℃16000g離心1min，去除血清中碎片成分。取稀釋血清80μL，進(jìn)行LC分離，流速0.125mL/min，在11～16min收集低豐度蛋白的流出組分。采用Bradord試劑盒檢測(cè)餾分蛋白濃度。其余樣本-80℃保存待用。2）蛋白定量標(biāo)記：1.2mL的預(yù)冷丙酮加入300μL低豐度蛋白血清，見沉淀物形成。4℃15000g離心100min，棄上清，沉淀室溫放置20min使丙酮揮發(fā)完全。然后加入20μL溶解緩沖液充分混勻，使樣品充分溶解。每組樣品取100μg，加入2倍體積的還原劑，充分混合，60℃孵育1h。管內(nèi)加入半胱氨酸封閉劑渦旋混合后室溫孵育10min。按1∶30（胰酶∶蛋白質(zhì)）的比例向樣品管內(nèi)加入消化酶，渦旋混合，37℃孵育16h。iTRAQ試劑室溫凍融，每管iTRAQ試劑加入70μL無(wú)水乙醇，渦旋混合，使之溶解后轉(zhuǎn)入樣品管。然后按照卵巢癌組加入質(zhì)量數(shù)118Da和正常對(duì)照組119Da的標(biāo)記分別加入樣品管，漩渦混勻，室溫孵育1h，真空冷凍干燥，去除標(biāo)記中的胰蛋白酶和未標(biāo)記的多肽；第8頁(yè)，共14頁(yè)?；舅悸泛头椒?、二氧化鈦富集磷酸化肽段：稱取1mgTiO2放入50%ACN/0.1%FA(40μL)中，制成勻漿液，裝入GELoader槍頭中，用惰性材料塞緊。裝好的微柱依次用40μL的0．1%FA，80%ACN/0.1%TFA，40μL×2的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA的溶液沖洗，將樣品注入微柱中，依次用40μL×2的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA，40μL80%ACN/0.1%TFA，40μLH2O洗脫，最后用10μL×2的5%NH3·H2O收集，并用甲酸調(diào)至pH3；稱取1mgC18-AQ材料裝柱(同上),將裝好的微柱依次用40μLACN，40μL×2的50%ACN/0.1%FA溶液沖洗，再用40μL×2的0.1%FA溶液平衡微柱，將上述富集到的收集液上樣，再用40μL×2的0.1%FA溶液脫鹽，最后用20μL×2的50%ACN/0.1%FA溶液洗脫收集并旋干，再用10μL的50%ACN/0.1%FA溶解；第9頁(yè)，共14頁(yè)?；舅悸泛头椒?、質(zhì)譜分析：采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)LC-MS/MS質(zhì)譜分析，濃縮的iTRAQ標(biāo)記樣本加入2mL稀釋液，調(diào)溶液pH值低于3。采用HPLC柱進(jìn)行陽(yáng)離子交換色譜分析。由強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱分離活的組份經(jīng)真空干燥，多肽采用20μL溶劑A重懸，NanoLC分離并在線連接電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用NanoAquityUPLC系統(tǒng)Nano在線連接電噴霧離子源的LTQOrbi?trapXL質(zhì)譜儀。所有MS/MS譜圖采用Thermo公司的SEQUEST軟件進(jìn)行，使用數(shù)據(jù)庫(kù)為人Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)（Release2010-04）。多肽分子量誤差范圍為15ppm，碎片離子誤差為0.1Da；5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：定量分析蛋白磷酸化位點(diǎn)變化差異。第10頁(yè)，共14頁(yè)。總結(jié)

預(yù)計(jì)達(dá)到以下目標(biāo)：①研究出卵巢癌血清定量疾病蛋白質(zhì)磷酸化修飾的差異②為卵巢癌早期診斷和篩查提供更有效的臨床價(jià)值。第11頁(yè)，共14頁(yè)。參考文獻(xiàn)【1】彭小寧,彭司華,曾小敏,卵巢癌早期診斷方法的研究進(jìn)展[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2007,27(6):490-492【2】李國(guó)慶，肖哲峰，劉建平，等，腫瘤：一種蛋白質(zhì)組病.2010,40（9）:788-794；【3】陳主初,梁宋平,肖志強(qiáng),等.腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué).長(zhǎng)沙:湖南科技出版社,2002.1—9：454-463；【4】李文凱,李子博.蛋白質(zhì)組學(xué)—一門正在崛起的蛋白質(zhì)分子生物學(xué),2007,12（9）20-25；【5】趙桂華，尹淑霞，郝萬(wàn)東,等.蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用.產(chǎn)業(yè)與科技論壇，2009,8(5):15-17；【6】梁前進(jìn)，王鵬程，白燕榮.蛋白質(zhì)磷酸化修飾研究進(jìn)展.科技導(dǎo)報(bào)，2012,30(31)，73-79；【7】楊策，王正國(guó)，朱佩芳.蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)磷酸化研究進(jìn)展.生理科學(xué)進(jìn)展.2004，35（2），119-124；【8】隋少卉，王京蘭，蔡耘，錢小紅.磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析和定量技術(shù)的研究進(jìn)展.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.2007,34(3):240-245【9】李峰，關(guān)勇軍，陳主初.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2001；11（6）165-168；【10】李莉，唐杰，于春霞.基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合2DnanoHPLC-ESI-OrbiTrapMS/MS技術(shù)篩選卵巢癌血清標(biāo)記物.中國(guó)腫瘤臨床,2012,39(24):2075-2077；【11】鄒麗娟,李娟,萬(wàn)慧慧.超濾膜截留-二氧化鈦選擇性富集-納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清中內(nèi)源性磷酸化肽,分析化學(xué)研究報(bào)告,2011,12,39(12),1781-1786；【12】王京蘭,錢小紅.磷酸化蛋白質(zhì)分析技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用,分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展,2005,7（7）：1029-1035；【13】MokSC,,ChaoJ,SkatesS,etal.Prostasin,potential

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