PH區(qū)帶逆流色譜技術(shù)

(pH—zone—refining

CountereurrenctChromatography)徐秀芳主要內(nèi)容PH區(qū)帶逆流色譜發(fā)展PH區(qū)帶逆流色譜原理影響分離效果的因素PH區(qū)帶逆流色譜應(yīng)用發(fā)展與現(xiàn)狀。逆流色譜(CountercurtChromatography,簡(jiǎn)稱CCC)是一種無需任何固體支撐體的液液分配色譜分離技術(shù)，被分離物質(zhì)根據(jù)其在互不混溶的兩相溶劑中的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離。由于不使用固體支撐介質(zhì)．因而避免了樣品的不可逆吸附引起和失真等，全回收成為可能。逆流色譜分離技術(shù)已經(jīng)被證明是一種非常有效的制各和半制各手段，近年來已被廣泛應(yīng)用于天然成分的分離純化。由于不使用固體支撐介質(zhì)，逆流色譜有著許多液相色譜所沒有的優(yōu)點(diǎn)：CCC柱可以通過改變不同的溶劑體系來分離不同極性的化合物；不必?fù)?dān)心粗樣會(huì)污染損壞CCC柱；同一根CCC柱可以用于分析量級(jí)也可用于制各量級(jí)的分離。因此放大起來比較簡(jiǎn)單。pH區(qū)帶逆流色譜（pH-zone-refiningcounterrentchromatography）由Ito于1994年首次提出，利用待分離有機(jī)酸堿的酸!堿解離常數(shù)及疏水性的不同進(jìn)行分離。與普通逆流色譜相比"其突出特點(diǎn)是在溶劑體系的固定相中加入保留酸（或堿）同時(shí)在流動(dòng)相中加入洗脫堿（或酸）不同物質(zhì)洗脫出來時(shí)伴隨著ph值的突變。該技術(shù)可以得到最小重疊的矩形峰"同時(shí)雜質(zhì)被集中在峰的兩側(cè)"具有樣品分離容量大。分離純度和分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。PH區(qū)帶逆流色譜的原理以分離堿性物質(zhì)為例(見圖1)與ph突變相對(duì)應(yīng)保留堿在柱子前沿形成一個(gè)邊界在邊界左側(cè)堿性待分離物質(zhì)從洗脫酸獲得質(zhì)子并進(jìn)入流動(dòng)相(位置4)溶質(zhì)正離子穿過邊界時(shí)置于高ph值范圍內(nèi)(位置1)于是被保留堿奪去質(zhì)子后回到疏水性的非離子形式并很快進(jìn)入固定相中(位置2)。當(dāng)保留堿邊界向前推移時(shí)失去了質(zhì)子的溶質(zhì)分子又被重新置于低ph值范圍內(nèi)(位置3)獲得質(zhì)子而回到流動(dòng)相中(位置4)這一過程不斷重復(fù)直至保留堿流出色譜柱。保留堿或酸的作用是在溶質(zhì)區(qū)前面將溶質(zhì)從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相中洗脫酸或堿的作用是在溶質(zhì)區(qū)后面將溶質(zhì)從固定相轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相中當(dāng)存在多種較大量的溶質(zhì)時(shí)具有最大=pka值和親水性的溶質(zhì)首先流出柱子依此類推并以不同溶質(zhì)區(qū)ph值的降低(或升高)為標(biāo)志達(dá)到分離目的(見圖2)編號(hào)1至3依次表示轉(zhuǎn)速為400r/min、600r/min、800r/min,4表示轉(zhuǎn)速前600r/min，然后調(diào)速至800r/min的情況。由圖3可知，轉(zhuǎn)速越大，保留值越高，分離效果越好。但是情況3和情況4的保留值比較接近，所以在通常的實(shí)驗(yàn)中普遍采用的都是情況4，這樣既能保證固定相保留值，也能使儀器不必要長(zhǎng)時(shí)間在800r/min以上高速運(yùn)轉(zhuǎn)，同時(shí)也避免了由于高速旋轉(zhuǎn)造成的乳化。根據(jù)色譜分辨率的計(jì)算公式：計(jì)算上述a、b、c圖的分辨率依次為0.9814，1.4150和2.0120溶劑系統(tǒng)中水的體積含量始終占50%，正丁醇的含量代表了系統(tǒng)的極性，含量高，極性大，含量低，極性小,分辨率與正丁醇含量（極性）的關(guān)系如圖所示進(jìn)樣量由圖6可知，只要在逆流色譜的處理范圍內(nèi)，進(jìn)樣量越大，重疊率越小，分離效果越好，這是因?yàn)樵趐h區(qū)帶逆流色譜中，流出物的濃度主要有洗脫酸（堿）的濃度決定。酸堿濃度由圖7可知，在其他條件不變的情況下，對(duì)于生物堿來說，洗脫酸濃度越小分離效果越好，在洗脫酸濃度為6mmol/L的時(shí)，RS=1.5,實(shí)現(xiàn)了完全分離。應(yīng)用pH區(qū)帶逆流色譜(pH—zone—refiningCCC)的洗脫色譜圖形與頂色譜和等速電泳相似，主要組分的峰組成一系列矩形色譜峰，各色峰之間很少重疊，一般針對(duì)可離子化的分子如羧酸、胺等。操作時(shí)選擇兩相體系如甲基叔丁基醚：水，平衡后取上層溶劑加入適量的作為“保留劑”的酸如三氟乙酸并作為固定相，下層溶劑加入適量的作為“取代劑”的堿如氨水并作為流動(dòng)相。以分離有機(jī)酸R1COOH、R2COOH、R3COOH(pKa1<pKa2<pKa3)為例(圖3)，首先將酸化的固定相注人色譜柱中，然后加入用固定相溶解的樣品。泵人流動(dòng)相后，在色譜柱足夠長(zhǎng)的情況下整個(gè)體系達(dá)到“等速”狀態(tài)，與氨水界面移動(dòng)的速度同步。酸性較強(qiáng)的R1C00H先與氨水作用，轉(zhuǎn)化為R1COO一和NH4+產(chǎn)生，但R1COO一隨即被酸性更強(qiáng)的CF3COOH質(zhì)子化，又變?yōu)镽1COOH回到固定相，CF3COO一和NH4+先洗脫出。同樣，CF3COOH消耗完變?yōu)镃F3COO一后，R1COOH提供質(zhì)子，使R2COO一轉(zhuǎn)化為R2COOH留在固定相，直至所有的R1COOH轉(zhuǎn)變?yōu)镽1COO一，并隨流動(dòng)相洗脫出，形成R1COO一的矩形色譜峰。與此類同樣，若被分離的樣品是堿類如生物堿等，也可以堿為保留劑，酸為取代劑，進(jìn)行pH區(qū)帶逆流色譜分離。此外，也可以選擇下相溶劑為固定相，上相溶劑為流動(dòng)相，因此，pH區(qū)帶逆流色譜擴(kuò)大了逆流色譜的應(yīng)用范圍，提高了樣品的進(jìn)樣量，可進(jìn)行制備性的樣品分離，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧雜蔥染料、生物堿、多酚和異黃酮類等化合物的分離方面得到應(yīng)用。如用正丁醇：0．03tool三氟乙酸(1：1)分離了粘菌素；用正丁醇：0．2tool甲酰氨分離了縮膽囊素。pH區(qū)帶逆流色譜也可以用于有機(jī)酸對(duì)映體的分離，1一甲基一4一甲氧甲基環(huán)己基甲酸的兩個(gè)異構(gòu)體由于立體位阻效應(yīng)不同使酸性產(chǎn)生差異(圖5)，從而得到分離。由于ph區(qū)帶逆流色譜屬于制備型色譜技術(shù)并具有分離效率高分離效果好雜質(zhì)易收集及可實(shí)現(xiàn)ph監(jiān)控等諸多優(yōu)點(diǎn)因此在未來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中擁有很大潛力和廣闊應(yīng)用空間目前該技術(shù)已經(jīng)用于許多混合物的分離并在天然產(chǎn)物如生物堿的分離中顯示出較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值對(duì)我國(guó)中草藥提純和分離工作也將有很大幫助如果能夠與其它技術(shù)有效結(jié)合并克服其自身限制相信其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑦M(jìn)一步拓寬技術(shù)水平將得