分子診斷與臨床1.分子診斷與臨床1.主要內(nèi)容概述分子診斷的常用技術(shù)分子診斷在臨床的應(yīng)用分子診斷在應(yīng)用中的問(wèn)題及對(duì)策分子診斷的發(fā)展方向2.主要內(nèi)容概述2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)臨床生化檢驗(yàn)學(xué)臨床免疫檢驗(yàn)學(xué)臨床微生物檢驗(yàn)學(xué)臨床血液檢驗(yàn)學(xué)臨床寄生蟲(chóng)學(xué)臨床分子診斷學(xué)(基因診斷=PCR?)科研平臺(tái)？3.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)3.分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的分支學(xué)科之一4.分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)4.分子診斷學(xué)的研究對(duì)象生物大分子核酸：DNA、RNA蛋白大分子體系基因細(xì)胞組織5.分子診斷學(xué)的研究對(duì)象生物大分子5.臨床學(xué)診斷細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)血清學(xué)診斷分子診斷生化學(xué)診斷臨床表現(xiàn)細(xì)胞膜不同診斷方法的研究對(duì)象6.臨床學(xué)診斷細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)血清學(xué)診斷分子分子診斷的策略遵循實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的基本原則不同疾病及病因采用不同方法根據(jù)檢測(cè)目的開(kāi)展不同層次的檢測(cè)注重環(huán)境基因組學(xué)研究成果發(fā)揮在耐藥性方面的潛在作用在疾病預(yù)測(cè)、健康檢查、個(gè)體化治療中的作用關(guān)注分子診斷中的醫(yī)學(xué)論理和生物安全問(wèn)題開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的方法7.分子診斷的策略遵循實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的基本原則7.二、分子診斷的主要技術(shù)低通量技術(shù)DNA分析：Southernblot、PCR、RFLP、ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量測(cè)定染色體分析：FISH、CGHRNA分析：ISH、Northernblot、RT-PCR蛋白質(zhì)分析：IHC、Westernblot

8.二、分子診斷的主要技術(shù)低通量技術(shù)8.高通量技術(shù)核酸測(cè)序技術(shù)—基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)生物芯片(基因芯片)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)2-DE質(zhì)譜技術(shù)：MALDI-TOF組織芯片蛋白質(zhì)組信息學(xué)9.高通量技術(shù)9.RLFP原理10.RLFP原理10.FISH[NTERT-1與人著絲粒DNA片段雜交（綠），與人端粒DNA片段雜交（紅）]11.FISH11.二、幾種常用的分子診斷技術(shù)核酸擴(kuò)增分子克隆核酸分子雜交DNA測(cè)序單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)生物芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)生物信息學(xué)12.二、幾種常用的分子診斷技術(shù)核酸擴(kuò)增12.1、PCR體外核酸擴(kuò)增生物技術(shù)領(lǐng)域最重要四項(xiàng)技術(shù)之一細(xì)胞整合技術(shù)分子克隆技術(shù)蛋白工程技術(shù)13.1、PCR體外核酸擴(kuò)增13.

模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖14.模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板2、分子克隆（基因克隆，基因重組）

基本步驟分切接轉(zhuǎn)篩含重組子的陽(yáng)性克隆DNA重組體連載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽(yáng)性克隆+受體細(xì)胞全基因分切篩轉(zhuǎn)15.2、分子克隆（基因克隆，基因重組）含重組子的陽(yáng)性克隆DNA重3、核酸分子雜交定義不同來(lái)源的、具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下通過(guò)堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程分子雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)DNA（RNA）的變性與復(fù)性16.3、核酸分子雜交定義16.核酸分子雜交基本類(lèi)型Southern雜交-----待測(cè)核酸是DNA片段Northern雜交-----待測(cè)核酸是RNA片段衍生類(lèi)型：斑點(diǎn)雜交、原位雜交等17.核酸分子雜交基本類(lèi)型17.Southernblot操作流程18.Southern18.19.19.斑點(diǎn)雜交示意圖

20.斑點(diǎn)雜交示意圖20.4、DNA測(cè)序已知序列的驗(yàn)證性測(cè)序策略未知序列的從頭測(cè)序策略

隨機(jī)測(cè)序法（鳥(niǎo)槍法、人工轉(zhuǎn)座子法）定向測(cè)序法（引物測(cè)序法、互套缺失法）全基因組測(cè)序策略21.4、DNA測(cè)序已知序列的驗(yàn)證性測(cè)序策略21.DNA測(cè)序常用技術(shù)鏈末端終止法（Sanger法）化學(xué)降解法測(cè)序新技術(shù)MALDI-TOFMS雜交測(cè)序法焦磷酸測(cè)序技術(shù)原子探針顯微鏡法單分子測(cè)序技術(shù)自動(dòng)化測(cè)序---常規(guī)應(yīng)用22.DNA測(cè)序常用技術(shù)鏈末端終止法（Sanger法）22.鏈末端終止法測(cè)序原理化學(xué)降解法測(cè)序原理23.鏈末端終止法測(cè)序原理化學(xué)降解法測(cè)序原理23.自動(dòng)化測(cè)序充分體現(xiàn)DNA序列自動(dòng)化分析技術(shù)的簡(jiǎn)單、安全、精確、并行和高效等特點(diǎn)目前，自動(dòng)化測(cè)序已成為DNA序列分析的主流，幾乎完全取代了手工測(cè)序類(lèi)型：基于單一熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)

基于多種熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)24.自動(dòng)化測(cè)序充分體現(xiàn)DNA序列自動(dòng)化分析技術(shù)的簡(jiǎn)單、安全、精確單熒光多熒光（四熒光）25.單熒光多熒光（四熒光）25.377型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀26.377型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀26.5、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)SNP：第三代遺傳標(biāo)志，是決定人類(lèi)疾病易感性和藥物反應(yīng)差異性的主要因素SNP檢測(cè)技術(shù)基本步驟靶序列的擴(kuò)增SNP特異位點(diǎn)的區(qū)分方法：雜交、PCR、分子構(gòu)象、酶法等數(shù)據(jù)的檢測(cè)分析方法：凝膠電泳、熒光檢測(cè)、基因芯片、質(zhì)譜分析等27.5、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)SNP：第三代遺傳標(biāo)志，是決定人類(lèi)主要的SNP檢測(cè)方法凝膠電泳分析技術(shù)SSCP、TTGE、TGGE、DGGE分子雜交技術(shù)ASO、DASH、PNA雜交、LNA雜交熒光共振能量轉(zhuǎn)移Taqman探針技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、蝎狀探針技術(shù)、替代探針技術(shù)28.主要的SNP檢測(cè)方法凝膠電泳分析技術(shù)28.PCR-SSCP29.PCR-SSCP29.6、生物芯片技術(shù)技術(shù)的核心：雜交技術(shù)實(shí)質(zhì)：分子生物間特異性相互作用（互補(bǔ)配對(duì)）步驟：已知物質(zhì)點(diǎn)樣（陣列）加標(biāo)記的待測(cè)樣品，雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析、處理優(yōu)點(diǎn)：高度并行性、多樣化、自動(dòng)化、微型化缺點(diǎn)：只能檢測(cè)已知的大分子不能發(fā)現(xiàn)未知的大分子30.6、生物芯片技術(shù)技術(shù)的核心：雜交技術(shù)30.應(yīng)用核酸分析（基因表達(dá)分析、基因突變檢測(cè)、基因測(cè)序、基因圖譜制作、多態(tài)性分析）、藥物研究、蛋白質(zhì)組鑒定及微生物菌種鑒定主要類(lèi)型基因（DNA）芯片RNA芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip

)31.應(yīng)用31.6400點(diǎn)的基因芯片（面積12×14mm)32.6400點(diǎn)的基因芯片32.7、蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)：從整體的角度，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的相互關(guān)系。研究對(duì)象的整體性研究目標(biāo)的動(dòng)態(tài)性體現(xiàn)生命的復(fù)雜性33.7、蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因所蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用蛋白質(zhì)與核酸間相互作用蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點(diǎn)的分離、分析與鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析生理與病理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)表達(dá)差異豐富與完善蛋白質(zhì)信息庫(kù)34.蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇：34.蛋白質(zhì)組學(xué)的常用分析技術(shù)從技術(shù)層面來(lái)講的，它是一門(mén)綜合的分析技術(shù)，主要有3個(gè)方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)平臺(tái)。蛋白質(zhì)組分離技術(shù)：雙向電泳（2-DE）蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)：圖像分析技術(shù)、微量測(cè)序、蛋白質(zhì)質(zhì)譜、氨基酸分析蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和生物信息學(xué)

35.蛋白質(zhì)組學(xué)的常用分析技術(shù)從技術(shù)層面來(lái)講的，它是一門(mén)綜合的分析2-DE36.2-DE36.酵母雙雜交技術(shù)的原理37.酵母雙雜交技術(shù)的原理37.8、生物信息學(xué)概念：以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)為主要手段，以計(jì)算機(jī)硬件、軟件和網(wǎng)絡(luò)為主要工具，對(duì)巨量的數(shù)量進(jìn)行處理、存儲(chǔ)、分配和解釋?zhuān)蔀榫哂忻鞔_生物學(xué)意義的生物信息，并通過(guò)對(duì)生物信息的查詢(xún)、搜索、比較和分析實(shí)現(xiàn)其研究目標(biāo)（基因組信息結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語(yǔ)言的根本規(guī)律律），解釋生命的遺傳語(yǔ)言，探索生命起源、生物進(jìn)化的基本規(guī)律，探索細(xì)胞、器官和個(gè)體發(fā)生、發(fā)育、衰亡等生命科學(xué)中的重大問(wèn)題。研究對(duì)象：生物學(xué)數(shù)據(jù)研究核心：基因組信息學(xué)38.8、生物信息學(xué)概念：以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)為主要手段，以計(jì)生物信息學(xué)廣義：使用數(shù)學(xué)和信息學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的生物數(shù)據(jù)和資料的一門(mén)學(xué)科。狹義：主要指基因組信息學(xué)，即以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為主要手段，采用計(jì)算機(jī)學(xué)和數(shù)學(xué)處理DNA及其編碼的大分子物質(zhì)的信息，尋找其規(guī)律性。流程：建立數(shù)據(jù)庫(kù)，將獲得的物質(zhì)信息進(jìn)行比較39.生物信息學(xué)廣義：使用數(shù)學(xué)和信息學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)：NCBIgenome、GDB、Ensembl、Genatlas模式生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)：SGD、MGI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)：GeneBank、EMBL-DNA、DDBJ、Unigene、HGMD蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：PIR、SWISS-PORT結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)：PDB、SCOP、CATH、COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)：KEGG、DIP、TRRD、ASDB40.現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)40.中國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)人核酸序列統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)41.中國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)41.三、分子診斷在臨床的應(yīng)用單基因疾病的分子診斷多基因疾病的分子診斷腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)感染性疾病的分子診斷在耐藥性研究中的價(jià)值在個(gè)體化治療中的應(yīng)用分子診斷在臨床的其他應(yīng)用42.三、分子診斷在臨床的應(yīng)用單基因疾病的分子診斷42.1、單基因疾病的分子診斷血紅蛋白病的分子診斷肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分子診斷血友病的分子診斷α1抗胰蛋白酶缺乏癥的分子診斷Leber`s遺傳性視神經(jīng)病變的分子診斷其他單基因疾病的分子診斷43.1、單基因疾病的分子診斷血紅蛋白病的分子診斷43.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析谷氨酸(GAN)纈氨酸(GUN)HbAHbS44.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析谷氨酸(GAN)鐮狀紅細(xì)胞貧血基因組的PCR-RFLP電泳圖45.鐮狀紅細(xì)胞貧血基因組的PCR-RFLP電泳圖45.DMD基因缺失的多重PCR診斷。共采用9對(duì)引物，可見(jiàn)患者（P）有電泳帶的缺失。46.DMD基因缺失的多重PCR診斷。共采用9對(duì)引物，可見(jiàn)患者（P2、多基因疾病的分子診斷糖尿病的分子診斷家族性高脂血癥的分子診斷高血壓的分子診斷支氣管哮喘的分子診斷皮膚的復(fù)雜疾病其他：冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、胃及十二指腸潰瘍、精神分裂癥、風(fēng)濕病、癲癇、甲亢、唇裂、腭裂等。47.2、多基因疾病的分子診斷糖尿病的分子診斷其他：冠心病、動(dòng)脈粥遺傳病的基因診斷方法選擇原則48.遺傳病的基因診斷方法選擇原則48.3、腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)腫瘤的分子分類(lèi)與分期腫瘤的分子標(biāo)志腫瘤的分子診斷腫瘤的分子預(yù)測(cè)49.3、腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)腫瘤的分子分類(lèi)與分期49.腫瘤的分子標(biāo)志50.腫瘤的分子標(biāo)志50.腫瘤基因的分子診斷腫瘤的早期診斷和篩選腫瘤的療效監(jiān)測(cè)腫瘤的預(yù)后判斷腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)主要方向51.腫瘤基因的分子診斷腫瘤的早期診斷和篩選主要方向51.4、感染性疾病的分子診斷診斷途徑：感染性病原體的分子診斷感染性病原體的分型檢測(cè)感染性病原體的耐藥監(jiān)測(cè)人感染性疾病的易感基因檢測(cè)感染組學(xué)----對(duì)感染性疾病的總體性和綜合性研究52.4、感染性疾病的分子診斷診斷途徑：52.感染性疾病的分子診斷分子診斷方法核酸雜交技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)基因定量診斷技術(shù)基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)53.感染性疾病的分子診斷分子診斷方法53.感染性疾病的分子診斷目前主要的應(yīng)用病毒的分子檢測(cè)細(xì)菌感染的分子檢測(cè)衣原體的分子檢測(cè)支原體的分子檢測(cè)螺旋體的分子檢測(cè)原蟲(chóng)的分子檢測(cè)54.感染性疾病的分子診斷目前主要的應(yīng)用54.5、分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用微生物耐藥性的研究耐藥基因的檢測(cè)與分析PCR、PCR-SSCP、PCR-RFLP、核酸雜交、FQ-PCR、基因芯片等耐藥菌株的鑒定與分析質(zhì)粒譜DNA指紋分析、DNA的特異性位點(diǎn)分析、全基因DNA指紋、基因芯片55.5、分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用微生物耐藥性的研究55.分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用腫瘤的多藥耐藥基因的檢測(cè)與分析主要的MDR基因mdr1---------p-蛋白MRP---------多藥耐藥相關(guān)蛋白LRP----------肺耐藥相關(guān)蛋白TopoⅡα----DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα同工酶GSTp1--------谷胱甘胱S-轉(zhuǎn)移酶P1-1同工酶56.分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用腫瘤的多藥耐藥基因的檢測(cè)與分析56、在個(gè)體化醫(yī)療中的應(yīng)用個(gè)體化醫(yī)療個(gè)體化醫(yī)療的前提藥物基因組學(xué)與個(gè)體化用藥腫瘤的個(gè)體化治療57.6、在個(gè)體化醫(yī)療中的應(yīng)用個(gè)體化醫(yī)療57.7、分子診斷的其他應(yīng)用在移植配型中的應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用在新生兒篩查中的應(yīng)用在預(yù)防醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用58.7、分子診斷的其他應(yīng)用在移植配型中的應(yīng)用58.RFLP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用59.RFLP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用59.四、分子診斷在應(yīng)用中的問(wèn)題及對(duì)策在感染性疾病檢測(cè)中的問(wèn)題與對(duì)策易感基因診斷中的問(wèn)題與對(duì)策腫瘤的分子診斷和預(yù)測(cè)的問(wèn)題與對(duì)策分子診斷中的倫理問(wèn)題分子診斷中的質(zhì)量問(wèn)題與標(biāo)準(zhǔn)化60.四、分子診斷在應(yīng)用中的問(wèn)題及對(duì)策在感染性疾病檢測(cè)中的問(wèn)題與對(duì)1.在感染性疾病檢測(cè)中的問(wèn)題與對(duì)策問(wèn)題：病原微生物日益復(fù)雜新病原體的出現(xiàn)耐藥株的出現(xiàn)對(duì)策：開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的新方法新方法與傳統(tǒng)方法、實(shí)驗(yàn)室檢查與臨床表現(xiàn)結(jié)合多種方法聯(lián)合應(yīng)用開(kāi)發(fā)新方法，加強(qiáng)耐藥性檢測(cè)利用人易感基因檢測(cè)進(jìn)行診斷（如SNP）61.1.在感染性疾病檢測(cè)中的問(wèn)題與對(duì)策問(wèn)題：61.2、易感基因診斷中的問(wèn)題與對(duì)策問(wèn)題：遺傳異質(zhì)性多因素復(fù)雜性假陽(yáng)性存在擬表型各種因素導(dǎo)致的誤導(dǎo)62.2、易感基因診斷中的問(wèn)題與對(duì)策問(wèn)題：62.易感基因診斷中的問(wèn)題與對(duì)策對(duì)策提高關(guān)聯(lián)性檢測(cè)的可能性選擇單體型作為標(biāo)志利用LD、tagSNP和單體型進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究采用大樣本研究提高關(guān)聯(lián)研究的效應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)遺傳標(biāo)志根據(jù)環(huán)境因素和多基因因素進(jìn)行分析63.易感基因診斷中的問(wèn)題與對(duì)策對(duì)策63.利用易感基因進(jìn)行健康預(yù)測(cè)的問(wèn)題單基因疾?。簷z測(cè)相關(guān)基因或染色體畸變做健康預(yù)測(cè)，或產(chǎn)前診斷-----可信的易感基因：只能作有限的參考

原因：易感基因的研究和檢測(cè)技術(shù)正處發(fā)展過(guò)程中并非所有疾病都可以預(yù)測(cè)現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的部分疾病的易感基因還難以直接應(yīng)用于臨床治療和預(yù)防64.利用易感基因進(jìn)行健康預(yù)測(cè)的問(wèn)題單基因疾?。簷z測(cè)相關(guān)基因或染色3、腫瘤分子診斷的問(wèn)題與對(duì)策癌基因的激活、抑癌基因的失活（或缺失）原癌基因細(xì)胞癌基因病毒癌基因生長(zhǎng)因子及受體、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等腫瘤抑制基因腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因腫瘤耐藥基因等65.3、腫瘤分子診斷的問(wèn)題與對(duì)策癌基因的激活、抑癌基因的失活（或癌基因或抑癌基因在正常細(xì)胞的基因組中存在表達(dá)/不表達(dá)狀態(tài)表達(dá)程度腫瘤標(biāo)志的特異性易感基因的關(guān)聯(lián)性腫瘤分子診斷的問(wèn)題與對(duì)策66.癌基因或抑癌基因在正常細(xì)胞的基因組中腫瘤分子診斷的問(wèn)題與對(duì)策4、分子診斷中的倫理問(wèn)題醫(yī)學(xué)論理學(xué)的一般原則：

有利、無(wú)害、公正、尊重遺傳服務(wù)：一種面向社會(huì)的應(yīng)用遺傳技術(shù)的醫(yī)學(xué)實(shí)踐需遵守醫(yī)學(xué)倫理學(xué)實(shí)施依賴(lài)于分子診斷技術(shù)

內(nèi)容：遺傳咨詢(xún)、遺傳檢查、遺傳篩查、基因治療、輔助生殖等

主要途徑：基因檢查、染色體檢查個(gè)人遺傳信息的不當(dāng)使用遺傳歧視67.4、分子診斷中的倫理問(wèn)題醫(yī)學(xué)論理學(xué)的一般原則：67.5、分子診斷中的質(zhì)量問(wèn)題和標(biāo)準(zhǔn)化分子診斷實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理一般實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理特殊性的質(zhì)量管理高技術(shù)性高嚴(yán)謹(jǐn)性高污染性分子診斷實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化68.5、分子診斷中的質(zhì)量問(wèn)題和標(biāo)準(zhǔn)化分子診斷實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理68五、分子診斷的發(fā)展方向DNADNA及其表達(dá)產(chǎn)物（mRNA和蛋白）單一技術(shù)多項(xiàng)技術(shù)的有機(jī)組合定性診斷半定量和定量診斷治療性診斷疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)性分析診斷技術(shù)由常規(guī)方法生物芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)范圍由單基因疾病、感染性疾病多基因疾病應(yīng)用范圍由疾病的診斷、治療生命科學(xué)、環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域69.五、分子診斷的發(fā)展方向DNADNA及其表分子診斷與臨床70.分子診斷與臨床1.主要內(nèi)容概述分子診斷的常用技術(shù)分子診斷在臨床的應(yīng)用分子診斷在應(yīng)用中的問(wèn)題及對(duì)策分子診斷的發(fā)展方向71.主要內(nèi)容概述2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)臨床生化檢驗(yàn)學(xué)臨床免疫檢驗(yàn)學(xué)臨床微生物檢驗(yàn)學(xué)臨床血液檢驗(yàn)學(xué)臨床寄生蟲(chóng)學(xué)臨床分子診斷學(xué)(基因診斷=PCR?)科研平臺(tái)？72.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)3.分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的分支學(xué)科之一73.分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)4.分子診斷學(xué)的研究對(duì)象生物大分子核酸：DNA、RNA蛋白大分子體系基因細(xì)胞組織74.分子診斷學(xué)的研究對(duì)象生物大分子5.臨床學(xué)診斷細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)血清學(xué)診斷分子診斷生化學(xué)診斷臨床表現(xiàn)細(xì)胞膜不同診斷方法的研究對(duì)象75.臨床學(xué)診斷細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)血清學(xué)診斷分子分子診斷的策略遵循實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的基本原則不同疾病及病因采用不同方法根據(jù)檢測(cè)目的開(kāi)展不同層次的檢測(cè)注重環(huán)境基因組學(xué)研究成果發(fā)揮在耐藥性方面的潛在作用在疾病預(yù)測(cè)、健康檢查、個(gè)體化治療中的作用關(guān)注分子診斷中的醫(yī)學(xué)論理和生物安全問(wèn)題開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的方法76.分子診斷的策略遵循實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的基本原則7.二、分子診斷的主要技術(shù)低通量技術(shù)DNA分析：Southernblot、PCR、RFLP、ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量測(cè)定染色體分析：FISH、CGHRNA分析：ISH、Northernblot、RT-PCR蛋白質(zhì)分析：IHC、Westernblot

77.二、分子診斷的主要技術(shù)低通量技術(shù)8.高通量技術(shù)核酸測(cè)序技術(shù)—基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)生物芯片(基因芯片)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)2-DE質(zhì)譜技術(shù)：MALDI-TOF組織芯片蛋白質(zhì)組信息學(xué)78.高通量技術(shù)9.RLFP原理79.RLFP原理10.FISH[NTERT-1與人著絲粒DNA片段雜交（綠），與人端粒DNA片段雜交（紅）]80.FISH11.二、幾種常用的分子診斷技術(shù)核酸擴(kuò)增分子克隆核酸分子雜交DNA測(cè)序單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)生物芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)生物信息學(xué)81.二、幾種常用的分子診斷技術(shù)核酸擴(kuò)增12.1、PCR體外核酸擴(kuò)增生物技術(shù)領(lǐng)域最重要四項(xiàng)技術(shù)之一細(xì)胞整合技術(shù)分子克隆技術(shù)蛋白工程技術(shù)82.1、PCR體外核酸擴(kuò)增13.

模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖83.模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板2、分子克隆（基因克隆，基因重組）

基本步驟分切接轉(zhuǎn)篩含重組子的陽(yáng)性克隆DNA重組體連載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽(yáng)性克隆+受體細(xì)胞全基因分切篩轉(zhuǎn)84.2、分子克隆（基因克隆，基因重組）含重組子的陽(yáng)性克隆DNA重3、核酸分子雜交定義不同來(lái)源的、具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下通過(guò)堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程分子雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)DNA（RNA）的變性與復(fù)性85.3、核酸分子雜交定義16.核酸分子雜交基本類(lèi)型Southern雜交-----待測(cè)核酸是DNA片段Northern雜交-----待測(cè)核酸是RNA片段衍生類(lèi)型：斑點(diǎn)雜交、原位雜交等86.核酸分子雜交基本類(lèi)型17.Southernblot操作流程87.Southern18.88.19.斑點(diǎn)雜交示意圖

89.斑點(diǎn)雜交示意圖20.4、DNA測(cè)序已知序列的驗(yàn)證性測(cè)序策略未知序列的從頭測(cè)序策略

隨機(jī)測(cè)序法（鳥(niǎo)槍法、人工轉(zhuǎn)座子法）定向測(cè)序法（引物測(cè)序法、互套缺失法）全基因組測(cè)序策略90.4、DNA測(cè)序已知序列的驗(yàn)證性測(cè)序策略21.DNA測(cè)序常用技術(shù)鏈末端終止法（Sanger法）化學(xué)降解法測(cè)序新技術(shù)MALDI-TOFMS雜交測(cè)序法焦磷酸測(cè)序技術(shù)原子探針顯微鏡法單分子測(cè)序技術(shù)自動(dòng)化測(cè)序---常規(guī)應(yīng)用91.DNA測(cè)序常用技術(shù)鏈末端終止法（Sanger法）22.鏈末端終止法測(cè)序原理化學(xué)降解法測(cè)序原理92.鏈末端終止法測(cè)序原理化學(xué)降解法測(cè)序原理23.自動(dòng)化測(cè)序充分體現(xiàn)DNA序列自動(dòng)化分析技術(shù)的簡(jiǎn)單、安全、精確、并行和高效等特點(diǎn)目前，自動(dòng)化測(cè)序已成為DNA序列分析的主流，幾乎完全取代了手工測(cè)序類(lèi)型：基于單一熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)

基于多種熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)93.自動(dòng)化測(cè)序充分體現(xiàn)DNA序列自動(dòng)化分析技術(shù)的簡(jiǎn)單、安全、精確單熒光多熒光（四熒光）94.單熒光多熒光（四熒光）25.377型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀95.377型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀26.5、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)SNP：第三代遺傳標(biāo)志，是決定人類(lèi)疾病易感性和藥物反應(yīng)差異性的主要因素SNP檢測(cè)技術(shù)基本步驟靶序列的擴(kuò)增SNP特異位點(diǎn)的區(qū)分方法：雜交、PCR、分子構(gòu)象、酶法等數(shù)據(jù)的檢測(cè)分析方法：凝膠電泳、熒光檢測(cè)、基因芯片、質(zhì)譜分析等96.5、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)SNP：第三代遺傳標(biāo)志，是決定人類(lèi)主要的SNP檢測(cè)方法凝膠電泳分析技術(shù)SSCP、TTGE、TGGE、DGGE分子雜交技術(shù)ASO、DASH、PNA雜交、LNA雜交熒光共振能量轉(zhuǎn)移Taqman探針技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、蝎狀探針技術(shù)、替代探針技術(shù)97.主要的SNP檢測(cè)方法凝膠電泳分析技術(shù)28.PCR-SSCP98.PCR-SSCP29.6、生物芯片技術(shù)技術(shù)的核心：雜交技術(shù)實(shí)質(zhì)：分子生物間特異性相互作用（互補(bǔ)配對(duì)）步驟：已知物質(zhì)點(diǎn)樣（陣列）加標(biāo)記的待測(cè)樣品，雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析、處理優(yōu)點(diǎn)：高度并行性、多樣化、自動(dòng)化、微型化缺點(diǎn)：只能檢測(cè)已知的大分子不能發(fā)現(xiàn)未知的大分子99.6、生物芯片技術(shù)技術(shù)的核心：雜交技術(shù)30.應(yīng)用核酸分析（基因表達(dá)分析、基因突變檢測(cè)、基因測(cè)序、基因圖譜制作、多態(tài)性分析）、藥物研究、蛋白質(zhì)組鑒定及微生物菌種鑒定主要類(lèi)型基因（DNA）芯片RNA芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip

)100.應(yīng)用31.6400點(diǎn)的基因芯片（面積12×14mm)101.6400點(diǎn)的基因芯片32.7、蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)：從整體的角度，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的相互關(guān)系。研究對(duì)象的整體性研究目標(biāo)的動(dòng)態(tài)性體現(xiàn)生命的復(fù)雜性102.7、蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因所蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用蛋白質(zhì)與核酸間相互作用蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點(diǎn)的分離、分析與鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析生理與病理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)表達(dá)差異豐富與完善蛋白質(zhì)信息庫(kù)103.蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇：34.蛋白質(zhì)組學(xué)的常用分析技術(shù)從技術(shù)層面來(lái)講的，它是一門(mén)綜合的分析技術(shù)，主要有3個(gè)方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)平臺(tái)。蛋白質(zhì)組分離技術(shù)：雙向電泳（2-DE）蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)：圖像分析技術(shù)、微量測(cè)序、蛋白質(zhì)質(zhì)譜、氨基酸分析蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和生物信息學(xué)

104.蛋白質(zhì)組學(xué)的常用分析技術(shù)從技術(shù)層面來(lái)講的，它是一門(mén)綜合的分析2-DE105.2-DE36.酵母雙雜交技術(shù)的原理106.酵母雙雜交技術(shù)的原理37.8、生物信息學(xué)概念：以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)為主要手段，以計(jì)算機(jī)硬件、軟件和網(wǎng)絡(luò)為主要工具，對(duì)巨量的數(shù)量進(jìn)行處理、存儲(chǔ)、分配和解釋?zhuān)蔀榫哂忻鞔_生物學(xué)意義的生物信息，并通過(guò)對(duì)生物信息的查詢(xún)、搜索、比較和分析實(shí)現(xiàn)其研究目標(biāo)（基因組信息結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語(yǔ)言的根本規(guī)律律），解釋生命的遺傳語(yǔ)言，探索生命起源、生物進(jìn)化的基本規(guī)律，探索細(xì)胞、器官和個(gè)體發(fā)生、發(fā)育、衰亡等生命科學(xué)中的重大問(wèn)題。研究對(duì)象：生物學(xué)數(shù)據(jù)研究核心：基因組信息學(xué)107.8、生物信息學(xué)概念：以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)為主要手段，以計(jì)生物信息學(xué)廣義：使用數(shù)學(xué)和信息學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的生物數(shù)據(jù)和資料的一門(mén)學(xué)科。狹義：主要指基因組信息學(xué)，即以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為主要手段，采用計(jì)算機(jī)學(xué)和數(shù)學(xué)處理DNA及其編碼的大分子物質(zhì)的信息，尋找其規(guī)律性。流程：建立數(shù)據(jù)庫(kù)，將獲得的物質(zhì)信息進(jìn)行比較108.生物信息學(xué)廣義：使用數(shù)學(xué)和信息學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)：NCBIgenome、GDB、Ensembl、Genatlas模式生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)：SGD、MGI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)：GeneBank、EMBL-DNA、DDBJ、Unigene、HGMD蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：PIR、SWISS-PORT結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)：PDB、SCOP、CATH、COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)：KEGG、DIP、TRRD、ASDB109.現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)40.中國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)人核酸序列統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)110.中國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)41.三、分子診斷在臨床的應(yīng)用單基因疾病的分子診斷多基因疾病的分子診斷腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)感染性疾病的分子診斷在耐藥性研究中的價(jià)值在個(gè)體化治療中的應(yīng)用分子診斷在臨床的其他應(yīng)用111.三、分子診斷在臨床的應(yīng)用單基因疾病的分子診斷42.1、單基因疾病的分子診斷血紅蛋白病的分子診斷肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分子診斷血友病的分子診斷α1抗胰蛋白酶缺乏癥的分子診斷Leber`s遺傳性視神經(jīng)病變的分子診斷其他單基因疾病的分子診斷112.1、單基因疾病的分子診斷血紅蛋白病的分子診斷43.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析谷氨酸(GAN)纈氨酸(GUN)HbAHbS113.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析谷氨酸(GAN)鐮狀紅細(xì)胞貧血基因組的PCR-RFLP電泳圖114.鐮狀紅細(xì)胞貧血基因組的PCR-RFLP電泳圖45.DMD基因缺失的多重PCR診斷。共采用9對(duì)引物，可見(jiàn)患者（P）有電泳帶的缺失。115.DMD基因缺失的多重PCR診斷。共采用9對(duì)引物，可見(jiàn)患者（P2、多基因疾病的分子診斷糖尿病的分子診斷家族性高脂血癥的分子診斷高血壓的分子診斷支氣管哮喘的分子診斷皮膚的復(fù)雜疾病其他：冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、胃及十二指腸潰瘍、精神分裂癥、風(fēng)濕病、癲癇、甲亢、唇裂、腭裂等。116.2、多基因疾病的分子診斷糖尿病的分子診斷其他：冠心病、動(dòng)脈粥遺傳病的基因診斷方法選擇原則117.遺傳病的基因診斷方法選擇原則48.3、腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)腫瘤的分子分類(lèi)與分期腫瘤的分子標(biāo)志腫瘤的分子診斷腫瘤的分子預(yù)測(cè)118.3、腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè)腫瘤的分子分類(lèi)與分期49.腫瘤的分子標(biāo)志119.腫瘤的分子標(biāo)志50.腫瘤基因的分子診斷腫瘤的早期診斷和篩選腫瘤的療效監(jiān)測(cè)腫瘤的預(yù)后判斷腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)主要方向120.腫瘤基因的分子診斷腫瘤的早期診斷和篩選主要方向51.4、感染性疾病的分子診斷診斷途徑：感染性病原體的分子診斷感染性病原體的分型檢測(cè)感染性病原體的耐藥監(jiān)測(cè)人感染性疾病的易感基因檢測(cè)感染組學(xué)----對(duì)感染性疾病的總體性和綜合性研究121.4、感染性疾病的分子診斷診斷途徑：52.感染性疾病的分子診斷分子診斷方法核酸雜交技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)基因定量診斷技術(shù)基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)122.感染性疾病的分子診斷分子診斷方法53.感染性疾病的分子診斷目前主要的應(yīng)用病毒的分子檢測(cè)細(xì)菌感染的分子檢測(cè)衣原體的分子檢測(cè)支原體的分子檢測(cè)螺旋體的分子檢測(cè)原蟲(chóng)的分子檢測(cè)123.感染性疾病的分子診斷目前主要的應(yīng)用54.5、分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用微生物耐藥性的研究耐藥基因的檢測(cè)與分析PCR、PCR-SSCP、PCR-RFLP、核酸雜交、FQ-PCR、基因芯片等耐藥菌株的鑒定與分析質(zhì)粒譜DNA指紋分析、DNA的特異性位點(diǎn)分析、全基因DNA指紋、基因芯片124.5、分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用微生物耐藥性的研究55.分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用腫瘤的多藥耐藥基因的檢測(cè)與分析主要的MDR基因mdr1---------p-蛋白MRP---------多藥耐藥相關(guān)蛋白LRP----------肺耐藥相關(guān)蛋白TopoⅡα----DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα同工酶GSTp1--------谷胱甘胱S-轉(zhuǎn)移酶P1-1同工酶125.分子診斷在耐藥性研究中的應(yīng)用腫瘤的多藥耐藥基因的檢測(cè)與分析56、在個(gè)體化醫(yī)療中的應(yīng)用個(gè)體化醫(yī)療個(gè)體化醫(yī)療的前提藥物基因組學(xué)與個(gè)體化用藥腫瘤的個(gè)體化治療126.6、在個(gè)體化醫(yī)療中的應(yīng)用個(gè)體化醫(yī)療57.7、分子診斷的其他應(yīng)用在移植配型中的應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用在新生兒篩查中的應(yīng)用在預(yù)防醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用127.7、分子診斷的其他應(yīng)用在移植配型中的應(yīng)用58.RFLP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用128.RFLP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用59.四、分子診斷在應(yīng)用中的問(wèn)題及對(duì)策在感染性疾病檢測(cè)中的