第三章:滅菌技術(shù)3.1.

滅菌的原理和方法3.2.培養(yǎng)基滅菌3.3.空氣滅菌生物生產(chǎn)過程是一個(gè)純培養(yǎng)過程，必須保證在生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)是無菌的(空氣、培養(yǎng)基、管路和設(shè)備)13.1.

滅菌的方法和原理◎.化學(xué)試劑滅菌法.◎.電磁波、射線滅菌法.◎.熱滅菌法(干熱、濕熱和火焰滅菌法).◎.過濾除菌法(阻留微生物，達(dá)到除菌的目的)2常用化學(xué)消毒劑及其使用方法消毒劑用途常用濃度使用方法1氧化劑：高錳酸鉀漂白粉

皮膚消毒發(fā)酵工廠環(huán)境消毒

0.1-0.25%2-5%

環(huán)境消毒可直接用于粉體2醇類：乙醇

皮膚及器物的消毒

70-75%

器物消毒浸泡30min3酚類：石碳酸來蘇爾

浸泡衣物、擦拭房間桌面、噴霧消毒皮膚、桌面、器械消毒

1-5%3-5%

4甲醛空氣消毒1-2%（10-15ml/m3）加熱熏蒸4h5銨鹽新潔而滅

皮膚、器械、環(huán)境消毒

0.1-0.25%

浸泡30min◎常用化學(xué)消毒劑及其使用方法3◎.電磁波、射線滅菌法.1：原理：利用高能電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子可以起到滅菌的作用。波長在(2.1-3.1)×10-7m的紫外線表面或空氣滅菌。波長在(0.06-1.4)×10-7m的X射線/γ射線(Co60)

在工業(yè)上還少采用。穿透力差設(shè)備投資高5◎.熱滅菌法.⊙干熱滅菌法：160℃，1h。使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用而死亡。用于實(shí)驗(yàn)器具和材料的滅菌。⊙濕熱滅菌法：利用飽和蒸汽滅菌。使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生凝固作用而致死。由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透力，冷凝時(shí)放出大量的潛熱，來源方便，價(jià)格低廉，滅菌效果好，是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌方法。一般條件為：121℃，30min。6利用過濾的方法截留微生物的方法。適合于澄清的液體和氣體的除菌。工業(yè)上常用此法制備大量的無菌空氣，供好氣性微生物的培養(yǎng)使用。⊙火焰滅菌法：利用火焰直接把微生物殺死。方法簡單、滅菌徹底，但適用范圍有限◎.過濾除菌法：7

8式中N－經(jīng)時(shí)間t后殘存的活菌濃度（個(gè)/L)，N0—開始滅菌時(shí)原有活菌濃度（個(gè)/L)；t－滅菌時(shí)間（s,min）K－滅菌速率常數(shù)或比死亡速率常數(shù)（s-1,min-1）它的大小與微生物的種類和加熱溫度有關(guān)。在同等溫度下，其值小，微生物的耐熱性強(qiáng)。從上式得出：t,N之間的關(guān)系為對數(shù)t=（2.303/K）㏒(N0/N)10dNs/dt=KRNR－KSNSdNR/dt=－KRNR解為：N/N0=KR/(KR－KS)[exp(KSt)－KS/KRexp(－KRt)]當(dāng)溫度在120℃時(shí)，接近一級反應(yīng)規(guī)律從以上可以看出：達(dá)到徹底的無菌，滅菌的時(shí)間為無限長。因此，工程設(shè)計(jì)以工業(yè)無菌為準(zhǔn)。

（二）溫度對死亡速率常數(shù)K值的影響：溫度可以影響反應(yīng)速度常數(shù)。其關(guān)系用Arrhenius方程表示:K=Aexp(－⊿E/RT)12式中：A—常數(shù)（s-1ormin-1)；R—?dú)怏w常數(shù)，8.314J/mol?K;T—絕對溫度，K;⊿E—微生物死亡活化能，J/mol.㏑K=㏑A－(⊿E/RT)……..⑴d㏑K/dT=⊿E/RT2………….⑵從（2）式看出：⊿E大，㏑K對T的變化率越大，即對溫度變化敏感。培養(yǎng)基中的熱滅菌既要?dú)⑺离s菌，又要保存其中的有效成分，因而研究熱對營養(yǎng)物質(zhì)的影響是十分必要的14（三）溫度對營養(yǎng)物質(zhì)分解破壞速率常數(shù)K’的影響同樣是為一級反應(yīng)：dC/dt=K’C其中：C—培養(yǎng)基內(nèi)易被破壞成分的濃度mol/L;t—滅菌時(shí)間（min,s);K’—分解速度常數(shù)。而且K’同樣受到溫度的影響，符合Arrhenius方程，即有：㏑K’=㏑A’－(⊿E’/RT)……..⑴’d㏑K’/dT=⊿E’/RT2………….⑵’15當(dāng)培養(yǎng)基溫度從T1升至T2時(shí)：對微生物其死亡速度常數(shù)的得比值K2/K1=exp[－(⊿E/R)(1/T2－1/T1)]∴㏑(K2/K1)=－(⊿E/R)(1/T2－1/T1)……..(3)同理：對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)㏑(K2’/K1’)=－(⊿E’/R）(1/T2-1/T1)…(4)(3)/(4)得：㏑(K2/K1)/㏑(K2’/K1’)=⊿E/⊿E’…(5)從(5)中看出，活化能大，反應(yīng)速度常數(shù)變化程度也大。16細(xì)胞芽孢和熱敏性營養(yǎng)物的活化能細(xì)菌芽孢和營養(yǎng)物⊿E(J/mol)細(xì)菌芽孢和營養(yǎng)物⊿E(J/mol)葉酸維生素B12維生素B1維生素B270340963009211498813葡萄糖嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草芽孢桿菌肉毒梭菌100488283460318210343300判斷采用高溫或是在低溫條件下殺菌是由該反應(yīng)的活化能的大小決定。滅菌溫度升高時(shí)，微生物殺死速率的提高要超過營養(yǎng)成分破壞的速率。在滅菌度相同的條件下，Kt=常數(shù)，因而高溫K值增大，時(shí)間必定大大縮短，營養(yǎng)物質(zhì)總的損失可以減少，因此高溫短時(shí)滅菌比低溫長時(shí)要好。此為滅菌動(dòng)力學(xué)得出的最重要的結(jié)論之一。17例1：當(dāng)殺菌溫度從120℃升至150℃，試計(jì)算維生素B1的分解速率常數(shù)KB和嗜熱脂肪芽孢桿菌的死亡速率常數(shù)KS。已知⊿ES=283460J/mol,As=1.06×1036(min-1)；⊿EB=92114J/mol,AB=1.06×1010(min-1)解：由（1）式，即㏑K=㏑A－(⊿E/RT)得㏒Ks=㏒As－⊿ES/(2.303RT)∴Ks在120℃時(shí)為0.024(min-1)150℃時(shí)為11.12(min-1)滅菌速率常數(shù)提高463倍。同樣地：KB在120℃時(shí)為0.055(min-1)，150℃時(shí)為0.404(min-1)，同樣的溫度變化僅提高7.3倍18203.2.2：影響滅菌的因素①培養(yǎng)基成分：影響微生物的耐熱性。②培養(yǎng)基的物理狀態(tài)：導(dǎo)熱方式③培養(yǎng)基的pH④培養(yǎng)基中的微生物量。N正比于N0⑤微生物細(xì)胞中的水含量。水⑥微生物細(xì)胞菌齡⑦微生物的耐熱性，細(xì)菌芽孢最耐熱⑧空氣排出情況⑨泡沫：熱量傳遞難避免突然進(jìn)汽或加大排氣。⑩攪拌M失活易21培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化加熱保溫冷卻（二）間歇滅菌的計(jì)算升溫階段：采用間接加熱（夾套、蛇管）；直接加熱（在培養(yǎng)基中直接通入蒸汽）；或二者同時(shí)進(jìn)行的加熱方式。23由微生物死亡動(dòng)力學(xué)公式dN/dt=－KNK=Aexp(－⊿E/RT)▽總=㏑N0/N=∫0tAexp(－⊿E/RT)dt㏑N0/N=㏑[(N0/N1)(N1/N2)(N2/N)]=㏑(N0/N1)+㏑(N1/N2))+㏑(N2/N)=▽加+▽保+▽冷24例3:培養(yǎng)基在30min內(nèi)從100℃升至121℃，或在17min內(nèi)從121℃冷卻至100℃，Richards簡便方法計(jì)算▽加和▽冷?解：在1℃/min條件下，培養(yǎng)基從120℃→121

℃，▽加為12.549，▽加=▽查表×升至恒溫的時(shí)間/(恒溫溫度-100℃)▽加=12.549×30/21=17.93▽冷=▽查表×降溫的時(shí)間/(開始降溫溫度-100℃)同理:▽冷=12.549×17/21=10.1626例4:若某發(fā)酵液中原含活菌1011個(gè),滅菌后的活菌數(shù)為10-3個(gè),且發(fā)酵液在16min內(nèi)從100℃被加熱到121℃，之后，在此溫度下保溫tmin，接著，發(fā)酵液再在17min內(nèi)從121℃冷卻到100℃，求所需保溫時(shí)間t。已知121℃的K=2.54min-1解：發(fā)酵液在殺菌前后體積不變∴▽總=㏑N0/N=㏑1011/10-3=㏑1014=32.2▽加=12.549×16/21=9.56▽冷=12.549×17/21=10.16又∵▽總=▽加+▽保+▽冷∴▽保=32.2-9.56-10.16=12.4827∵▽保=∫0tAexp(－⊿E/RT)dt=Kt∴t=▽保/K=12.48/2.54=4.91(min)升溫階段對滅菌的貢獻(xiàn)▽加/▽總=9.56/32.2=0.29降溫階段對滅菌的貢獻(xiàn)▽冷/▽總=10.16/32.2=0.31從上例說明升溫和冷卻階段對整個(gè)滅菌過程來說，效果十分可觀。一般地▽加/▽總占0.2，而▽冷/▽總占0.05，保溫階段▽保/▽總占0.7528●配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70℃，防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲?！襁B消塔（加熱塔）使培養(yǎng)基迅速（20s)升溫（126-132℃）?！窬S持罐：使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。2-7min.●冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50℃，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)302、噴射加熱連續(xù)滅菌流程313、薄板換熱器連續(xù)滅菌流程作業(yè)：P90;1;3;6323.3.空氣滅菌好氧微生物在發(fā)酵過程中需氧。而空氣中夾帶有大量的各類雜菌，因而在培養(yǎng)系統(tǒng)通入空氣之前須除菌。生產(chǎn)中應(yīng)用的無菌空氣認(rèn)為10-3。一般空氣中的含量103-104個(gè)/m3,菌體的平均尺寸為0.6μm。3.3.1空氣滅菌的方法空氣中微生物種類：包括細(xì)菌、細(xì)菌和霉菌孢子，酵母菌和病毒。研究其分布情況有利于選取良好的取風(fēng)位置和提高空氣除菌效率。數(shù)量與環(huán)境溫度和濕度有關(guān)?！虺鞘兄锌諝馕⑸锏暮看笥谵r(nóng)村和山區(qū)的◎地面空氣微生物的含量大于高空中的?！虺睗駵嘏哪戏降貐^(qū)微生物的含量大于干燥寒冷的北方地區(qū)?！驂m埃數(shù)量與微生物量呈線性關(guān)系（y=0.003x-2.6)33－熱滅菌法Decker等發(fā)現(xiàn)懸浮于空氣中的細(xì)菌孢子在218℃，24s內(nèi)可被殺死。利用空氣壓縮時(shí)溫度升高來殺死微生物—熱滅菌方法（屬于干熱滅菌)。壓力與溫度的關(guān)系為T2=T1(P2/P1)(m-1)/m式中,T1,T2—分別是空氣壓縮前后的溫度,K;P1,P2—分別是壓縮前后的的空氣壓力，Pa;m—多變指數(shù)，1.25。實(shí)際工藝所采用進(jìn)口空氣溫度T1=60-70℃,P2/P1=6,則出口溫度達(dá)到200℃以上（203-217℃），即可達(dá)到滅菌的目的。該方法已成功地應(yīng)用在丙酮、丁醇、淀粉酶和2，3—丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)。其工藝流程為3435－輻射滅菌和化學(xué)滅菌法在發(fā)酵工業(yè)上大規(guī)模的制備無菌空氣尚待經(jīng)一步研究.－靜電除菌法使空氣中的微粒（水霧、油霧、塵埃和微生物）在靜電場的作用下會(huì)被電離成帶電微粒，然后將其鋪集在電極上。對1μ的微粒去除率高達(dá)99%，耗電量小[處理1000m3空氣/(0.4-0.8kW)],氣體壓力損失小，但對很小的微粒，由于所帶電荷小，靜電引力接近于氣流對微粒的拖動(dòng)力或布朗擴(kuò)散動(dòng)量時(shí)，不能除去。同時(shí)設(shè)備龐大，一次性投資費(fèi)用高。36－介質(zhì)過濾除菌法工業(yè)上最常用的空氣除菌方法。是通過過濾介質(zhì)阻截空氣中所含微生物，從而獲得無菌空氣。過濾介質(zhì)孔隙絕對過濾:孔徑(0.01-0.2μ)小于微生物粒子（0.5-2μ)的微孔過濾膜。相對過濾：過濾介質(zhì)孔隙大于微生物直徑。如棉花、活性炭、玻璃纖維等3.3.2過濾介質(zhì)除菌的原理棉花纖維直徑16-20μ,孔隙直徑20-50μ,微生物直徑0.5-2μ.微粒隨空氣流通過一定厚度的過濾層時(shí)，濾層纖維所形成的網(wǎng)格對氣流進(jìn)行無數(shù)次的阻礙，從而無數(shù)次的改變氣流的運(yùn)動(dòng)速度和方向而繞流運(yùn)動(dòng)，這將引起微粒對濾層纖維產(chǎn)生慣性撞擊、重力沉降、攔截、布朗擴(kuò)散、靜電引力等作用，將微粒捕獲在纖維表面實(shí)現(xiàn)過濾。38●慣性撞擊截流作用機(jī)理為空氣過濾器的主要作用。滯留微粒的寬度區(qū)間b與纖維直徑的df之比—慣性撞擊捕集率η1=b/df其中η1是慣性準(zhǔn)數(shù)(φ）的函數(shù)。即，η1=f(φ)與纖維直徑、微粒的直徑和微粒的速度關(guān)系為φ

=(Cρpd2pν0)/(18μdf)其中:C,克寧漢修正系數(shù)；ν0，空氣在纖維間的真實(shí)速度；ρp，dp為微粒的密度和直徑；μ為空氣的黏度；df為纖維直徑。從公式可以看出：當(dāng)過濾器和空氣中的微粒一定時(shí)，影響鋪集率的參數(shù)為ν0。ν

0為某一臨界值，η1=0，實(shí)驗(yàn)測得φ=1/16時(shí)滿足此條件，求出νc=1.25(μdf)/(Cρpd2p).39●攔截滯留作用機(jī)理當(dāng)氣流速度小于慣性撞擊的臨界速度時(shí)，η顯著下降，若繼續(xù)下降時(shí)，η不再繼續(xù)下降，反而有所回升，即為攔截滯留在起作用;其經(jīng)驗(yàn)公式為從式中看出η2與微粒直徑和纖維直徑之比有關(guān)，同時(shí)與空氣流速成反比，即當(dāng)氣流速度低時(shí)截流才起作用，當(dāng)微粒直徑為1μm,C=11.46,μ=1.86×10-5(Pa.s),ρp=1000(kg/m3),則vc=1.8×104df(m/s)纖維細(xì),對捕集有利.η

2=[2(1+R)㏑(1+R)－(1+R)+(1－R)-1]/2(2－㏑Re)式中微粒直徑與纖維直徑的比值R=dp/df,氣流雷諾數(shù)Re=df

ν0ρ/μ40●布朗擴(kuò)散作用機(jī)理布朗擴(kuò)散的運(yùn)動(dòng)距離很短，在流速和纖維間隙大的條件下不起作用，當(dāng)微粒擴(kuò)散的距離x大于微粒離纖維表面的距離，則微粒會(huì)由于布朗擴(kuò)散作用的存在，增加了纖維的截流作用。布朗擴(kuò)散作用于微粒和纖維直徑有關(guān)，并與流速成反比，在流速很小時(shí)，是介質(zhì)過濾除菌的重要作用機(jī)理之一。4142●重力沉降作用機(jī)理微粒受到兩種力重力氣流拖帶力，當(dāng)氣流速度很小時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出重力沉降的作用●靜電吸附作用機(jī)理微生物帶有與過濾介質(zhì)表面相反的電荷；或介質(zhì)表面有感應(yīng)電荷，使微生物被吸附。43過濾除菌機(jī)制隨著流速的不同，其中到作用的機(jī)制也不同。當(dāng)氣流速度較大時(shí)，慣性撞擊起主要作用。表現(xiàn)在隨著流速的增加，除菌效率也增加。當(dāng)氣流速度較小時(shí)，擴(kuò)散起主要作用，表現(xiàn)在隨速度的增加而降低。當(dāng)氣流速度中等時(shí)，截流起主要作用。表現(xiàn)在氣流速度增大，除菌效率下降。3.3.3空氣過濾時(shí)的對數(shù)穿透定律當(dāng)空氣中的微粒穿過一定厚度的濾層時(shí)，不斷地被捕捉，含量逐漸減少，表現(xiàn)為類似一級衰減規(guī)律的形式即：dN/dl=－KN……………①44初始條件：N0,N,進(jìn)出濾層微生物的濃度。濾層厚度：0，LK,K’阻塞因素（1/m,1/cm),反映的是介質(zhì)阻止微生物穿透的能力，由①式積分的㏑N/N0=-KL或㏒(N0