納米生物傳感器在新型冠狀病毒檢測(cè)中的應(yīng)用2019新型冠狀病毒（2019novelcoronavirus，2019-nCoV）是一種在世界范圍內(nèi)快速傳播，具有極強(qiáng)傳染性的新型冠狀病毒［1］。因而，快速而準(zhǔn)確地早期診斷新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）尤其重要。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）是檢測(cè)2019-nCoVRNA的“金標(biāo)準(zhǔn)”和確診2019-nCoV感染的重要病原學(xué)證據(jù)［2］，但該平臺(tái)具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、便攜性差等缺點(diǎn)［3］。納米生物傳感器是一種將納米材料與生物傳感技術(shù)相結(jié)合的新型生物檢測(cè)平臺(tái)。近些年，石墨烯、碳納米管（carbonnanotube，CNT）等納米材料由于其獨(dú)特性質(zhì)，如比表面積高、微尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等［4］，被廣泛用于構(gòu)建高性能納米生物傳感器。目前，納米生物傳感器已被廣泛應(yīng)用于核酸［4］、蛋白質(zhì)［5］、葡萄糖［6］、細(xì)菌［7］、病毒［8］等的高靈敏檢測(cè)。本文概述了納米生物傳感器的工作原理及分類，著重綜述了近一年來(lái)所報(bào)道的各種納米生物傳感器在檢測(cè)2019-nCoV中的應(yīng)用。一、納米生物傳感器的工作原理及分類納米生物傳感器是一種基于納米技術(shù)和生物傳感技術(shù)，對(duì)檢測(cè)體系中待測(cè)物質(zhì)的濃度或活性進(jìn)行檢測(cè)的電子裝置。納米材料的尺寸既非典型的微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng)，因而納米材料呈現(xiàn)出常規(guī)材料不具備的優(yōu)越性能［4］。納米生物傳感器將納米材料作為一種新型生物傳感介質(zhì)，與傳統(tǒng)生物傳感器相比，體積更小、分析速度更快。納米生物傳感器通常由3部分構(gòu)成，即感受器、換能器和檢測(cè)器［9］。感受器的主要功能是對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性捕獲，如抗體對(duì)抗原的特異性捕獲，受體對(duì)配體分子的特異性捕獲等。換能器（如各種電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)晶體管等），主要負(fù)責(zé)將感受器捕獲到的特異性生物識(shí)別信息轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的物理化學(xué)信號(hào)，如光信號(hào)、電信號(hào)等。納米生物傳感器換能器的設(shè)計(jì)中往往會(huì)引入納米材料以提高傳感器的檢測(cè)性能，如石墨烯和CNT具有良好的導(dǎo)電性和較大比表面積等特點(diǎn)，因而往往被用來(lái)修飾各種電極，以制備性能優(yōu)越的電化學(xué)生物傳感器、場(chǎng)效應(yīng)晶體管（fieldeffecttransistor，F(xiàn)ET）生物傳感器等。檢測(cè)器，即負(fù)責(zé)檢測(cè)并記錄各種物理化學(xué)信號(hào)的傳感元件。當(dāng)檢測(cè)體系中存在靶標(biāo)物質(zhì)時(shí)，感受器首先對(duì)其進(jìn)行特異性捕獲，隨后換能器將這種特異性結(jié)合信息進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)換（如抗體功能化的FET生物傳感器將抗原-抗體特異性結(jié)合信息轉(zhuǎn)化石墨烯表面電荷密度的改變，即電信號(hào)），最后由檢測(cè)器對(duì)換能器獲得的特異性物理化學(xué)信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)、記錄。因?yàn)榫哂辛藖單⒚壮叽缂?jí)別的換能器、探針（感受器）或者納米微系統(tǒng)，納米生物傳感器的各項(xiàng)性能大幅提升，但納米生物傳感器目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，仍有大量的工作需要推進(jìn)。納米生物傳感器按換能方式的不同可分為電化學(xué)納米生物傳感器、光學(xué)納米生物傳感器、熱敏納米生物傳感器等；也可以按檢測(cè)對(duì)象的不同分為葡萄糖納米生物傳感器、核酸納米生物傳感器、蛋白質(zhì)納米生物傳感器等二、納米生物傳感器在檢測(cè)2019-nCoV中的應(yīng)用2019-nCoV核酸檢測(cè)和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)是評(píng)估患者感染階段以及預(yù)測(cè)其傳染性和預(yù)后的重要手段［10］。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中也明確指出COVID-19確診病例需有病原學(xué)證據(jù)陽(yáng)性結(jié)果RT-qPCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性；或病毒基因測(cè)序與已知的新型冠狀病毒高度同源［11］。因而，RT-qPCR是目前臨床上檢測(cè)2019-nCoV核酸最常用的生物技術(shù)，該方法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。然而，該方法不僅檢測(cè)步驟繁瑣，需要高度專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室，還具有檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)［12］。因此，RT-qPCR在即時(shí)檢測(cè)及基層醫(yī)院的應(yīng)用方面存在諸多限制，仍然不能完全滿足臨床需求。相比RT-qPCR，納米生物傳感器則可用于免擴(kuò)增、簡(jiǎn)單快速的2019-nCoV檢測(cè)。以下分別介紹基于2019-nCoV核酸檢測(cè)的納米生物傳感器和基于2019-nCoV抗原檢測(cè)的納米生物傳感器。1.基于2019-nCoV核酸檢測(cè)的納米生物傳感器：基于石墨烯納米生物傳感器檢測(cè)2019-nCoV的研究工作正日益受到關(guān)注。Damiati等［13］在石墨烯工作電極修飾鏈霉親和素，隨后將與ORF1ab基因互補(bǔ)的、生物素標(biāo)記的DNA探針固定到傳感器表面，從而構(gòu)建了可用于2019-nCoV檢測(cè)的石墨烯電化學(xué)傳感器。該傳感器可用于快速、靈敏（約5×105拷貝/ml）、免PCR擴(kuò)增的2019-nCoV檢測(cè)。最近，Li等［12］則報(bào)道了一種原位沉積金納米顆粒、嗎啉功能化的石墨烯FET生物傳感器以進(jìn)一步提高對(duì)2019-nCoVRNA的檢測(cè)靈敏度。一方面，金納米顆粒相比石墨烯可以結(jié)合更多的嗎啉探針?lè)肿?；另一方面，嗎啉作為一種肽核酸，不帶任何電荷，嗎啉與2019-nCoVRdRp雜交不受靜電排斥的影響，因而雜交效率大大提高。該傳感器的靈敏度為2.23×105拷貝/ml，檢測(cè)速度快（2min），免PCR擴(kuò)增，僅需10μl樣本即可完成檢測(cè)。此外，該傳感器還成功實(shí)現(xiàn)了30份臨床樣本的檢測(cè)，結(jié)果與RT-qPCR高度一致（Kappa指數(shù)可達(dá)0.92）。Alafeef等［14］利用石墨烯電化學(xué)生物傳感器結(jié)合電信號(hào)讀出裝置實(shí)現(xiàn)了高選擇性、靈敏（6.9×103拷貝/ml）、簡(jiǎn)單快速的2019-nCoVN基因檢測(cè)。同時(shí)，該平臺(tái)可以以近100%的準(zhǔn)確性和特異性區(qū)分22例COVID-19患者和26例健康無(wú)癥狀受試者。Zhao等［15］則開發(fā)了一種基于對(duì)硫杯［8］芳烴功能化石墨烯的超夾心型電化學(xué)生物傳感器以用于2019-nCoVRNA的高靈敏檢測(cè)（200拷貝/ml）。該方法檢測(cè)成本低，免PCR擴(kuò)增，同時(shí)還能與智能手機(jī)連接傳輸檢測(cè)結(jié)果，非常簡(jiǎn)單便攜。此外，該傳感器成功用于檢測(cè)25例陽(yáng)性確診患者和8例康復(fù)后復(fù)陽(yáng)患者不同體液來(lái)源的88份臨床樣本，檢測(cè)陽(yáng)性率分別為85.5%和46.2%，明顯高于RT-qPCR（56.5%和7.7%）的檢測(cè)陽(yáng)性率。除此之外，基于磁性納米顆粒（magneticnanoparticles，MNP）和DNA納米材料的納米生物傳感器檢測(cè)2019-nCoVRNA的工作亦有報(bào)道。Tian等［16］基于滾環(huán)擴(kuò)增（rollingcircleamplification，RCA）技術(shù)和MNP制備了一種光磁納米生物傳感器用于2019-nCoVRdRp檢測(cè)，該生物傳感器的檢測(cè)限約為2.41×105拷貝/ml，可區(qū)分2019-nCoV與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒。Chaibun等［17］則構(gòu)建了一種基于RCA的超靈敏電化學(xué)生物傳感器用于快速檢測(cè)2019-nCoVRNA。該傳感器檢測(cè)2019-nCoVN和S基因的最低檢測(cè)限均為103拷貝/ml，可成功將其用于106份臨床樣本的實(shí)際檢測(cè)中，與RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果一致性可達(dá)100%。以上報(bào)道的納米生物傳感器雖然具有免PCR擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，但大多便攜性不好、成本較高，在偏遠(yuǎn)貧困地區(qū)并不適用。值得欣慰的是，基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）、一系列CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）研發(fā)的側(cè)向?qū)游銎脚_(tái)最近被越來(lái)越多的報(bào)道證實(shí)其可用于低成本、便攜、快速的2019-nCoVRNA檢測(cè)［18,

19,

20］。Broughton等［18］報(bào)道了一種可用于簡(jiǎn)單快速（45min）檢測(cè)呼吸道拭子中2019-nCoVRNA的CRISPR-Cas12a側(cè)向?qū)游銎脚_(tái)（命名為DETECTR）。與RT-qPCR不同的是，Broughton等［18］利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP）技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。該平臺(tái)主要是基于Cas12a-gRNA（2019-nCoVN/E基因特異性向?qū)NA）復(fù)合物中的gRNA特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因，有效激活Cas12a蛋白的核酸酶切活性，從而酶切檢測(cè)體系中熒光探針，使得體系熒光得到有效恢復(fù)的原理?；谝陨显砑懊庖吣z體金層析技術(shù)，Broughton等［18］成功將其用于83份臨床樣本的實(shí)際檢測(cè)，陽(yáng)性病例、陰性病例與RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果的一致性分別可達(dá)95%和100%。該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)2019-nCoVRNA檢測(cè)僅需一根“試紙條”和簡(jiǎn)易的熒光讀出設(shè)備，因而實(shí)用性和便攜性好，適用于各種需要即時(shí)診斷的場(chǎng)景。Kellner等［19］則制備了一種基于CRISPR-LwaCas13a的SHERLOCK檢測(cè)平臺(tái)。該平臺(tái)的基本原理與DETECTR類似，不同的是該平臺(tái)利用RPA（重組酶聚合酶擴(kuò)增）技術(shù)直接對(duì)病毒RNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，最終進(jìn)入CRISPR-LwaCas13a體系實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度為104~105拷貝/ml，檢測(cè)時(shí)間僅需1h左右。除此之外，還有AIOD-CRISPR等平臺(tái)，但檢測(cè)原理大同小異［20］?；?019-nCoV核酸檢測(cè)的納米生物傳感器及RT-qPCR之間的比較見表1。目前大部分報(bào)道的2019-nCoV核酸納米生物傳感器相比RT-qPCR雖然具有免PCR擴(kuò)增、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，但標(biāo)本前處理過(guò)程中仍需提取病毒RNA。同時(shí)，這些納米生物傳感器的靈敏度并不能媲美RT-qPCR，不能完全滿足臨床需求。因而，基于2019-nCoV核酸檢測(cè)的納米生物傳感器的研究工作仍有待進(jìn)一步推進(jìn)，可通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)各種信號(hào)放大策略，以進(jìn)一步提高其檢測(cè)靈敏度，同時(shí)優(yōu)化檢測(cè)流程以縮短其檢測(cè)時(shí)間。2.基于2019-nCoV抗原檢測(cè)的納米生物傳感器：近些年來(lái)，基于石墨烯的FET納米生物傳感器已被廣泛用于各類物質(zhì)的直接檢測(cè)。因而，用于2019-nCoV直接檢測(cè)的石墨烯FET生物傳感器的研發(fā)一直是COVID-19疫情暴發(fā)以來(lái)廣大研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)領(lǐng)域。COVID-19疫情暴發(fā)不久，Seo等［21］報(bào)道了一種2019-nCoV刺突蛋白（S蛋白）抗體功能化的石墨烯FET生物傳感器。當(dāng)標(biāo)本中存在2019-nCoV時(shí)，其S蛋白與傳感器表面的抗體特異性結(jié)合，由于S蛋白帶有負(fù)電荷，因而可引起石墨烯表面電荷密度的改變，最終通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)前后的電學(xué)信號(hào)改變即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。由于石墨烯對(duì)微小電荷改變十分敏感，因而即使是微量的2019-nCoV存在于體系中也可以被檢出。該傳感器檢測(cè)限為1fg/ml，無(wú)需核酸提取與擴(kuò)增，可直接實(shí)現(xiàn)對(duì)2019-nCoV表面抗原的特異性檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，Torrente-Rodríguez等［22］則構(gòu)建了一種可以實(shí)現(xiàn)2019-nCoVN蛋白、S1蛋白特異性抗體和C反應(yīng)蛋白多重檢測(cè)的無(wú)線遠(yuǎn)程醫(yī)療電化學(xué)生物傳感平臺(tái)。該平臺(tái)使用激光雕刻的石墨烯，可大規(guī)模制備，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)COVID-19患者血液和唾液樣本中3種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。因而，該傳感器在遠(yuǎn)程醫(yī)療護(hù)理和即時(shí)疫情監(jiān)控方面具有很大的應(yīng)用潛力。隨后，基于CNT和過(guò)渡金屬二硫?qū)倩锏腇ET生物傳感器也被陸續(xù)報(bào)道可用于高靈敏的2019-nCoV檢測(cè)。Shao等［23］在Seo等［21］工作的基礎(chǔ)上分別制備了2019-nCoVS蛋白抗體和核衣殼蛋白（N蛋白）抗體功能化的單壁CNT-FET生物傳感器以用于2019-nCoV直接檢測(cè)。該傳感器的檢測(cè)機(jī)制同Seo等［21］的工作類似。該平臺(tái)檢測(cè)S蛋白和N蛋白的靈敏度分別為0.55fg/ml、0.016fg/ml，檢測(cè)速度快（約5min）、特異性好。該傳感器還可有效用于38份臨床樣本的直接檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)約82%（S蛋白）。Fathi-Hafshejani等［24］則報(bào)道了一種2019-nCoVS蛋白抗體功能化的二硒化鎢（WSe2）FET生物傳感器。該傳感器的靈敏度可達(dá)2.5×104

fg/ml。除此之外，基于DNA納米材料的生物傳感器也被報(bào)道可用于2019-nCoV的直接檢測(cè)。Zhang等［25］制備了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的G-四鏈體/血紅素DNA酶化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)以用于2019-nCoVN蛋白檢測(cè)，該平臺(tái)的靈敏度為6.46fg/ml，血清回收實(shí)驗(yàn)中的回收率可達(dá)80.0%~91.4%，在COVID-19的早期篩查和快速診斷方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。以上基于2019-nCoV抗原檢測(cè)的納米生物傳感器之間的比較見表2。絕大多數(shù)基于2019-nCoV抗原檢測(cè)的納米生物傳感器的檢測(cè)限在fg/ml級(jí)別，檢測(cè)時(shí)間短，可用于直接臨床樣本中的2019-nCoV。相比2019-nCoV核酸檢測(cè)生物傳感器，2019-nCoV抗原檢測(cè)生物傳感器設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，成本更為低廉，且無(wú)需病毒核酸提取與擴(kuò)增，因而有效縮短了檢測(cè)周期，在COVID-19即時(shí)診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。三、展望本綜述介紹了納米生物傳感器的檢測(cè)原理和分類，著重討論了其近一年來(lái)在2019-nCoV檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)展，包括2019-nCoV核酸和表面抗原的特異性檢測(cè)?；?019-nCoV核酸檢測(cè)的納米生物傳感器表現(xiàn)出免擴(kuò)增、檢測(cè)時(shí)