神經免疫學檢驗的開發(fā)研究和臨床應用規(guī)范勢在必行神經免疫病是由環(huán)境和遺傳因素共同參與、通過累及神經系統(tǒng)正常器官和組織的異常免疫細胞及分子介導、進而導致神經系統(tǒng)器質性損傷和/或功能障礙的一類疾病。典型疾病包括中樞神經系統(tǒng)的視神經脊髓炎譜系疾?。╪euromyelitisopticspectrumdisorder，NMOSD）、多發(fā)性硬化（multiplesclerosis，MS）和自身免疫性腦炎（autoimmuneencephalitis，AIE）；周圍神經系統(tǒng)的吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barrésyndrome，GBS）和神經肌接頭的重癥肌無力（myastheniagravis，MG）等。此類疾病有下列特點：（1）各年齡段均有發(fā)生，青壯年占比高，極大損害患者的神經功能、生活質量和社會經濟能力；（2）臨床表型異質性大，早期易誤診漏診；（3）從復發(fā)到緩解，病程長且異質性大，預測復發(fā)及評估疾病活動性十分困難；（4）免疫治療的療效差異大，缺少指導個體化治療和病情監(jiān)測的指標。在檢驗領域，由研究者發(fā)起的臨床研究（investigatorinitiatetrial，IIT）還較少，基礎免疫與臨床轉化間存在差距，檢測技術和方法學誤差、技術規(guī)范和質控標準尚有待完善或提高，目前難以有效服務于精準醫(yī)學時代的臨床實踐［1］。數百年前天文學家伽利略提出的“測量一切可測之物，并把不可測的變?yōu)榭蓽y”，正好指明了所需的解決當下神經免疫學檢測項目和技術諸多難題的方向。此言有兩層含義：“把不可測的變?yōu)榭蓽y”是要汲取基礎免疫學、生物技術、信息學和人工智能等的最新成果，實現免疫檢測技術的精準化和可及化；“測量一切可測之物”是要求不斷發(fā)現并驗證神經免疫學檢測指標，幫助臨床醫(yī)生更準確、高效地診斷疾病、評估病情轉歸和預測復發(fā)，開創(chuàng)基于免疫狀態(tài)活動性和神經功能制定個體化治療方案的新范式。一、神經免疫學檢測項目要應對“測量一切可測之物”的挑戰(zhàn)臨床上用于神經免疫病診斷和監(jiān)測的主要有自身抗體、特定蛋白以及免疫狀態(tài)（免疫細胞、炎癥因子等）等指標。第一類是自身抗體。神經免疫病自身免疫反應的靶點是位于神經系統(tǒng)的自身抗原分子。許多神經肌肉組織的結構蛋白和多糖分子具有抗原性，針對它們的自身抗體可導致相應疾病。根據靶抗原在神經組織及細胞定位的不同，自身抗體可分為針對神經細胞胞內抗原和細胞表面（跨膜）抗原的抗體［2］。針對神經元胞內抗原的神經元核抗體1型（antineuronalnuclearantibody-1，ANNA-1，Hu）抗體、抗浦肯野細胞胞漿抗體1（antineuronalnuclearantibody-2，ANNA-2，Yo）、Ma2、抗突觸囊泡蛋白（amphiphysin）抗體、人抗神經元核抗體2型（Ri）抗體、抗塌陷蛋白反應介質蛋白5（collapsinresponse-mediatorprotein5，CV2/CRMP5）抗體、針對神經元胞內的突觸蛋白谷氨酸脫羧酶65（glutamicaciddecarboxylase65，GAD65）抗體以及針對星型膠質細胞胞內膠質纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）抗體屬于前者［3］；針對神經元表面抗原的自身免疫性腦炎抗體包括［抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體抗體、抗富含亮氨酸膠質瘤失活1蛋白（leucine-richglioma-inactivated1protein，LGI1）抗體、接觸蛋白相關蛋白-2（contactin-associatedprotein-like2，Caspr2）抗體、抗α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacidreceptor，AMPAR）抗體、抗γ氨基丁酸受體B（γ-aminobutyricacidreceptor-B，GABAB）抗體］等，針對星型膠質細胞終足表面蛋白—水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）抗體，針對髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（myelinoligodendrocyteglycoprotein，MOG）的抗體，針對周圍神經郎飛結或結旁區(qū)域抗原，例如神經束蛋白155（neurofascin155，NF155）、神經束蛋白186（neurofascin186，NF186）和神經肌接頭抗原，例如乙酰膽堿受體（acetylcholinereceptor，AChR）、肌肉特異性受體酪氨酸激酶（muscle-specificreceptortyrosinekinase，MuSK）屬于后者［4］。一些抗原在中樞和周圍神經均有分布，針對它們的抗體如神經節(jié)苷脂GQ1b抗體、Caspr2抗體可同時導致中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)受累。隨著新抗體不斷被發(fā)現，對一些罕見神經免疫病的識別也不斷提高。需要首先明確這些神經系統(tǒng)自身抗體的致病性及臨床意義，避免給臨床醫(yī)生在診斷和治療監(jiān)測中帶來困惑并增添不必要的費用。為此，需要區(qū)分其為常規(guī)型還是研究型檢測項目：前者經過實驗室及臨床隊列驗證，有明確的診斷價值，部分有治療監(jiān)測價值，且有較高的敏感度和/或特異度，可在臨床常規(guī)開展；后者尚未經過臨床成規(guī)模驗證，僅有個例報道或初步隊列研究報道，敏感度和特異度較低（表1）。第二類是與神經免疫病相關的特定蛋白的檢測。腦脊液寡克隆區(qū)帶（oligoclonalband，OCB）是MS的關鍵診斷標志物［5］。MS患者僅在腦脊液出現血清中沒有出現的條帶，即為腦脊液特異性OCB陽性，提示患者中樞神經系統(tǒng)內有持續(xù)性B淋巴細胞反應［6］。一般MS患者OCB陽性后不會轉為陰性，除非使用那他珠單抗或自身造血干細胞移植等強效免疫治療。腦脊液OCB陽性亦可見于其他特發(fā)性炎性脫髓鞘疾?。╥diopathicinflammatorydemyelinatingdiseases，IIDD），如NMOSD、MOG抗體相關疾?。∕OGantibodyassociateddisorders，MOGAD）與AIE。在中樞神經系統(tǒng)感染、風濕病的神經系統(tǒng)并發(fā)癥等疾病也可檢測到腦脊液中的OCB，但通常不是持續(xù)存在。在西方國家約90%以上的臨床確診MS病例存在腦脊液特異性OCB；而在早期報道的中國MS患者腦脊液特異性OCB陽性率僅為35%~68%［7］。這種差異是由于種族免疫背景、環(huán)境因素還是檢測差異所致尚不清楚。所以，建立腦脊液OCB規(guī)范化檢測、室間比對和結果互認對于該病的診斷、流行病學研究和新藥臨床試驗至關重要。由筆者團隊牽頭開展的一項全國多中心的、由研究者發(fā)起的臨床研究“中國腦脊液寡克隆區(qū)帶研究（ChiCTR2000040363）”，已建立起腦脊液OCB檢測標準化操作流程（standardoperatingprocedure，SOP）和實驗室的室間比對［7］?；诖耍菊n題組檢測MS、非MS的中樞神經免疫病和非免疫病患者腦脊液OCB陽性率和條帶類型，以及反映血腦屏障通透性指標（QAlb）和中樞神經系統(tǒng)B淋巴細胞反應活動性指標（IgG指數、24h鞘內合成率），以期較為全面總結中國MS患者的神經免疫學表型。神經絲蛋白輕鏈（neurofilamentlightchains，NfL）是一種組成神經元細胞骨架的特異性蛋白，當各種病因導致神經元損傷時可被釋放至細胞外。一項隨訪長達15年的前瞻性隊列研究結果顯示，基線血清NfL含量的水平與MS患者最終臨床擴展致殘量表評分（expandeddisabilitystatusscale，EDSS）評分呈正相關，能夠有效評估MS患者預后，其預測敏感度達88.9%，特異度為47.4%。與此同時，還有學者發(fā)現那他珠單抗治療后的復發(fā)-緩解型MS患者血清NfL水平顯著降低。NfL升高還可見于多種神經系統(tǒng)疾病，其檢測意義在于動態(tài)提示神經元損傷用于疾病監(jiān)測，而非用于診斷疾病。此外，還有一些研究型特種蛋白與免疫反應的活動性相關，它們能否作為有效評估疾病進展、療效和預后的生物學標志物還值得商榷（表2）。第三類是反映機體免疫狀態(tài)的指標，包括淋巴細胞亞群及炎癥因子等，屬于研究型檢測指標，它們可以通過流式細胞技術定量或半定量評估?？捎脝蝹€細胞或分子的數值形成評價指標，亦可采用細胞或分子模式的改變來反映免疫狀態(tài)。促炎性因子如白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12、IL-6、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-α以及干擾素-γ和抑炎性因子IL-10、IL-4以及轉化生長因子（transforminggrowthfactor，TGF）-β在MS患者CSF及血清中隨著疾病的狀態(tài)改變而動態(tài)變化。二、神經免疫學檢測技術要應對“把不可測的變?yōu)榭蓽y”的挑戰(zhàn)神經免疫病的診斷和監(jiān)測在很大程度上依賴于實驗室指標對中樞或周圍神經系統(tǒng)免疫系統(tǒng)的生理或病理狀態(tài)改變能否及時作出可靠而且動態(tài)的反映。隨著檢測技術的發(fā)展，抗體和其他生物標志物的檢測在定量檢測范圍及檢測技術方法的準確性方面都已取得長足的進展。目前神經自身抗體檢測方法主要有間接免疫熒光法（indirectimmunofluorescencetesting，IIFT）、膜條法即線性免疫印跡（lineimmunoassay，LIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）、放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）；根據不同反應基質分為基于轉染靶抗原的細胞免疫熒光法（cell-basedassay，CBA）和基于組織底物的免疫檢測法（tissue-basedassay，TBA）。采用不同方法檢測的敏感度和特異度不同，通常在自身免疫疾病，誤診為此類疾病時可能啟動長期免疫治療，帶來不良反應和高額花費，特異性優(yōu)先有助于保障較低的誤診率。以MG的AChR抗體檢測為例，RIA法是最早使用、傳統(tǒng)檢測方法，但RIA法需要使用放射性同位素，而ELISA法無需同位素且試劑盒有效使用時間長、可及性好。RIA和ELISA試劑盒經過臨床驗證，有良好的檢測范圍和檢測精度，已成為常規(guī)型項目。RIA和ELISA均為定量檢測，其界值的建立對陽性患者的判斷至關重要。近來國內研究者報道AChR抗體的定量檢測界值優(yōu)化流程，為了消除自身免疫反應非特異性結合的影響，使用健康對照和其他免疫疾病聯(lián)合作為對照組，并采用平均值±3倍標準差或對照組中最高抗體水平建立的界值使對照組的假陽性率最低，而在代表性MG人群中的真陽性率并未明顯減少。用建立的界值在代表性MG人群及其亞組中評價，其診斷效力高于ROC法建立的界值，且RIA和ELISA法檢測結果的相關性及陽性者的判斷一致性均很高［8］。但兩者對一些低親和力AChR抗體檢出能力受限，基于細胞的抗體檢測方法（cell-basedassay，CBA）既可檢測高親和力抗體，亦可檢出低親和力抗體。有研究報道用RIA法檢測AChR抗體陰性的MG患者中，38.1%用CBA法可檢出聚集型AChR抗體，檢測特異度為100%。此類患者的特點是兒童起病、受累輕微、易于緩解和療效較好，提示CBA法的優(yōu)勢是能夠檢出部分定量方法無法檢測到AChR抗體的患者。但目前CBA法只能做到定性分析及相對半定量，且多為實驗室內檢測（in-housetesting），可及性有限，數據缺乏室間比對，因此屬研究型檢測，尚需經過規(guī)范的臨床診斷效能驗證及與商品化RIA和ELISA試劑盒檢測結果的比對形成實驗室自建檢測項目（laboratorydevelopedtest，IDT）［6，9］。AIE抗體的檢測則更為復雜。由于神經元細胞內抗原所處的細胞內特殊部位，需要通過直接提取抗原的方法進行檢測，常用LIA法或ELISA法。但此類方法提取抗原多為線性構象或簡單立體構象，檢測的特異度和檢測濃度范圍受限。有研究報道在經免疫組化法確定為CV2抗體陽性的53例副腫瘤綜合征患者的血清樣本，應用商業(yè)化LIA試劑盒發(fā)現4例為陰性，提示LIA法可能無法檢測到針對CV2分子某些特殊構象的抗體而造成假陰性結果。而抗神經細胞表面抗原位于細胞表面，基于提取抗原的LIA法、ELISA法和RIA法以及基于CBA法的技術均可應用，臨床上以CBA法常用。CBA法可采用活細胞或固定細胞為基質來檢測。一項多中心研究比較固定細胞、活細胞組合IIF和活細胞組合FACS3種方法對MOG抗體的檢測效能，提示相較于固定細胞，2種活細胞方法在檢測MOG抗體時均顯示更高的特異度和敏感度［10］。但需注意，CBA法多批次間的細胞有效表達率和穩(wěn)定性方面需要嚴格質控。TBA法用嚙齒類或靈長類動物腦組織切片，通過與抗體結合來檢測針對已知和未知細胞表面和胞內抗原的抗體，可以明確細胞表面或胞內定位并同時檢出多種抗體。一項針對抗NMDAR抗體的單中心研究比較TBA和CBA的敏感度，發(fā)現TBA法和CBA法在CSF中的敏感度相同（100%），而在血清中TBA的敏感度（91.6%）甚至略高于固定CBA法（86.8%）［11］。但是，TBA法需要檢驗判讀者具有豐富的讀片經驗。TBA法目前主要用于CBA法不能檢測到已知抗體時探索未知抗體，或在初步檢出已知抗體但仍不確定時驗證已知抗體，不能單獨用于診斷，應結合臨床和其他指標與方法學檢測，故TBA法不適合推薦為常規(guī)型檢測方法，還需進一步驗證。隨著生物靶向藥物的應用，淋巴細胞亞群和免疫細胞表達及其分泌的炎癥因子或趨化因子，以及神經細胞損傷后所釋放的特定蛋白檢測愈顯重要。通過檢測T或B淋巴細胞亞群有助于及時調整用藥方案，但系統(tǒng)誤差對檢測結果帶來的影響不容忽視。筆者團隊最近報道2例NMOSD患者用利妥昔單抗治療，并定期檢測總B細胞與特定B細胞亞群比例，發(fā)現總B細胞、記憶B細胞即使超過文獻報道復發(fā)界值1%和0.05%時，患者并未出現病情復發(fā)［12］。因此在臨床實踐中尋找合適的預測臨床事件界值十分重要，有助于避免過度治療帶來的風險。三、神經免疫學檢測的開發(fā)研究和臨床應用規(guī)范勢在必行1.規(guī)范開展神經免疫學檢測項目的臨床開發(fā)研究：目前神經免疫學檢測項目的臨床研究開展較少，對IIT的開展尚無統(tǒng)一規(guī)范。檢驗項目的開展需要系統(tǒng)評價檢測自身的準確性（敏感度和特異度）及診斷價值（陽性預測值和陰性預測值）。準確性由檢測體系決定，關鍵在于定量檢測的界值設定和定性檢測的判讀標準。診斷價值需考慮鑒別診斷的價值及疾病的患病率以及以篩查還是確診為目標等因素。即使檢測體系的準確性好，在患病率低的神經免疫疾病普遍檢測的價值也不大，反而可能因假陽性而導致過度診斷罕見神經免疫疾病，并帶來潛在的治療相關不良反應。用敏感度過高的檢測篩查無不良預后或無有效干預的疾病則導致患者心理負擔和后續(xù)一系列檢查的浪費。正如新藥需要科學設計的臨床試驗一樣，檢測試劑盒上市前也需要臨床試驗。臨床檢驗項目的開發(fā)具有不同分期。Ⅰ期研究采用數十份研究疾病和健康對照的樣本進行比較，用于設定定量界值和定性判讀標準，并初步評價檢測體系的敏感度和特異度；Ⅱ期研究采用數十例至100例更廣泛臨床疾病譜患者與需要鑒別的其他疾病對照的樣本，用于進一步完善定量界值和定性判讀標準，并驗證其在病譜代表性患者群體的診斷效能，Ⅰ期和Ⅱ期研究可采用回顧性獲得的樣本和臨床資料。Ⅲ期研究則采用前瞻性獲得更多例數的擬診患者和鑒別診斷患者的樣本和臨床資料，檢測在診斷之前完成，用于驗證真實世界的診斷效能。盡管商品化試劑盒有其推薦界值，但實際上許多試劑盒獲批時的參考值也是通過有限的樣本建立的，尤其是缺乏疾病譜中主要臨床特征信息，無法驗證其在具體臨床特征患者的診斷表現，不能準確代表這類疾病的正常值范圍。因此，十分必要在各自實驗室采用臨床信息完整且主要臨床特征的分布與其在自然史隊列中分布相同的驗證人群，并結合健康對照和疾病對照，建立本實驗室的參考值或判讀標準。不同方法間診斷效能的比較則優(yōu)選出最佳檢測方法。2012年的一項關于AQP4抗體檢測方法學的大型多中心隊列納入NMOSD、MS和其他神經免疫病的患者，對3種不同檢測方法（CBA、TBA、ELISA）的診斷效能進行系統(tǒng)評估。結果顯示，使用商業(yè)化CBA和ELISA試劑盒檢測血清AQP4抗體對于診斷NMOSD的特異度均達到100%，敏感度分別為68%和60%，而TBA法的診斷敏感度僅為50%左右，這一結論為之后臨床檢測的方法學選擇提供了理論基礎。2.根據臨床意義優(yōu)化神經免疫學檢測項目和方法形成標準化檢測方案和流程：各實驗室開展項目的檢測原理和方法、采用商品化或自制試劑盒、操作流程以及參考標準各不相同為給臨床解讀檢測結果帶來極大困惑。建立神經免疫學檢測的SOP和規(guī)范迫在眉睫。意大利神經免疫學會采用問卷調查方式對MS、NMOSD、AIE、副腫瘤綜合征、周圍神經病、MG患者免疫檢測項目類型、年檢量、檢測方法及外部質控等方面對實驗室間差異進行評估，于2016年發(fā)布該國神經免疫實驗室檢測標準化指南，此后不斷更新［13］。中國免疫學會于年2020年發(fā)布《自身免疫病診斷中抗體檢測方法的推薦意見》，結合專家調查問卷和對參考文獻的證據級別評分，提出針對包括神經自身抗體在內的各類別自身抗體的檢測技術指南。建議在檢測系統(tǒng)性自身免疫病的抗體時首先使用以嚙齒類或靈長類動物組織為檢測基質的TBA間接免疫熒光法進行初篩，再通過ELISA或CBA等方法進行確認和定量分析。但神經自身抗體涉及腦脊液和血清檢測，且不同疾病中自身抗體產生在中樞或外圍循環(huán)有所不同，需要考量是否有條件并是否適合用統(tǒng)一的篩查驗證過程［14,

15］。對于單個免疫檢測指標，在同一患者身上進行檢測方法間的比較甚為重要，包括同一檢測的室間比較和不同方法間的比較。室間比對需以一定的SOP作為基礎，并在不同實驗室同期對相同的樣本進行檢測和結果判讀，以評估實驗室間的標準化實施情況及結果判讀一致性。如前述本課題組已經建立的腦脊液OCB檢測SOP和室間比對規(guī)范。不同方法之間的比較有助于選擇最合理的檢測方法。檢測體系中使用的抗原和標記二抗等方法學差異使不同檢測方法的敏感度和特異度存在不同，如采用IgG的重鏈Fc片段特異性二抗可同時提高MOG抗體和MusK抗體檢測的敏感度和特異度。不同方法間檢測的一致性及互補性也是臨床診斷中的重要問題，如AChR抗體檢測，采用表達轉染肽段分子形成一定立體結構抗原的CBA法的優(yōu)勢是在有低親和力AChR抗體的個體中更敏感地檢測出該抗體，但可能無法檢測出一些RIA法可以檢測到的低水平非低親和力AChR抗體。此外，需要形成界限值定量結果或存疑判讀結果情況下的進一步檢測流程，包括考慮到合并疾?。ㄈ顼L濕性疾?。┑挠绊?，明確高于界限值的百分比及是否定量和定性結合判斷最終結果。獲得最終的臨床診斷及干預后結果的反饋，將有助于這一流程的優(yōu)化。3.需要建立臨床和檢測醫(yī)生的雙向互動機制，形成“來