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DB61陜 西 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB61/T1521.3—20213TechnicalSpecificationsforDairyGoatTechnicalSpecificationsforDairyGoatFarming—Part3:Double-genebreeding2021121720220117陜西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB61/T1521.3DB61/T1521.3—2021DB61/T1521.3DB61/T1521.3—2021目??次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1選育方法 1選擇程序 2附錄A（資料性）擴充特異引物 3II前??言DB61/T1521《奶山羊養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范》分為如下部分：1部分：關(guān)中奶山羊良種鑒定；2部分：引進(jìn)奶山羊良種鑒定；3部分：雙基因良種選育；4部分：種公羊飼養(yǎng)管理；——第5部分：后備羊培育；——第6部分：泌乳奶山羊健康養(yǎng)殖；7部分：人工授精；8部分：胚胎移植；——第9部分：苜蓿半干青貯；10部分：疫病防控；11部分：機器擠奶。本文件根據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)則起草。本部分由西北農(nóng)林科技大學(xué)提出。本部分由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件根據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)則起草。本部分由西北農(nóng)林科技大學(xué)提出。本部分由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本部分主要起草人：安小鵬、侯金星、曹芳君、楊少華、李廣、宋宇軒、田秀娥、付明哲、張磊。本部分由西北農(nóng)林科技大學(xué)負(fù)責(zé)解釋。本部分首次發(fā)布。聯(lián)系信息如下：單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)電話址：陜西楊凌示范區(qū)西農(nóng)路22號郵編：712100II奶山羊養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范第3部分：雙基因良種選育范圍本部分規(guī)定了高產(chǎn)良種奶山羊選育方法、選育程序內(nèi)容要求。本部分適用于以催乳素受體和促黃體素beta亞基基因選育關(guān)中奶山羊、莎能奶山羊等良種奶山羊。規(guī)范性引用文件本部分無規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本部分。3.1基因gene位于細(xì)胞染色體上具有遺傳效應(yīng)的DNA片段，是調(diào)控生物性狀的基本遺傳單位。3.2催乳素prolactin催乳素prolactin為動物垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，由199個氨基酸殘基組成。3.3受體receptor可與細(xì)胞外專一信號分子（配體）結(jié)合引起細(xì)胞反應(yīng)的蛋白質(zhì)，分為細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)受體。3.4催乳素受體prolactinreceptor催乳素受體位于山羊的16(LF)IF)及短受體SF1aSF1b)。不同催乳素受體由同一基因編碼，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后選擇性剪接而生成。PRLR是調(diào)控山羊產(chǎn)奶性能和產(chǎn)羔性能的重要候選基因。4選育方法4.1篩選高產(chǎn)個體篩選頭胎產(chǎn)羔數(shù)達(dá)到2只以上的奶山羊，以及產(chǎn)奶第3個月日均產(chǎn)奶量達(dá)到4kg以上的高產(chǎn)個體作為功能基因檢測的對象。14.2檢測高產(chǎn)個體基因型采用基因測序的方法對高產(chǎn)個體中的催乳素受體基因（PRLR）和促黃體素beta亞基（LHβ）基因進(jìn)行基因分型。選擇程序血液采集從山羊的頸靜脈采取1mL的血樣或從耳部采取0.5g的耳組織。DNA提取利用DNA提取試劑盒從血液或耳組織中提取基因組DNA。擴增目的片段根據(jù)催乳素受體基因（PRLR）和促黃體素beta亞基（LHβ）基因的DNA序列分別設(shè)計擴增PRLR基因外顯子9和LHβ基因5′非翻譯區(qū)的特異引物（附錄A）。檢測目的片段利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的目的片段。DNA利用利用DNA測序技術(shù)檢測基因的分型和統(tǒng)計不同個體的基因型?；蛐瓦x配從5.5中檢測的個體中篩選具有催乳素受體基因（PRLR）的GG基因型以及促黃體素beta亞基（LHβ）基因的CC基因型的優(yōu)秀個體進(jìn)行雜交或者選同交配?；蛐偷臋M交固定在不同基因型雜交后代中篩選同時具有GG和CC基因型的個體進(jìn)行橫交固定。純合基因型個體組群在橫交固定的個體中檢測和篩選基因型聚合純化在一起的個體組群。穩(wěn)定基因型采用基因型選同交配的方法穩(wěn)定基因型，從而形成產(chǎn)羔率和產(chǎn)奶量高的奶山羊核心群。選育高產(chǎn)奶山羊新品種（系）對含有以上22附錄A（資料性）雙基因型聚合育種技術(shù)用的分子生物學(xué)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），DNA測序，基因克隆，瓊脂糖凝膠電泳。雙基因型聚合育種技術(shù)用統(tǒng)計方法多因素方差分析和線性回歸模型。雙基因型聚合育種技術(shù)所需儀器設(shè)備PCR擴增儀（可設(shè)定溫度梯度）；電子天平（精度為0.0001g）；常溫高速離心機（最大轉(zhuǎn)速為15300rpm）；低溫冷凍離心機（能設(shè)定為4℃）；高壓滅菌鍋（工作蒸氣壓力0.5MPa）；凝膠成像儀（提供白光和紫外光以及藍(lán)光光源進(jìn)行拍攝凝膠）；水浴鍋（可設(shè)定恒定溫度）；垂直電泳槽（用于蛋白樣品的電泳）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（用于DNA樣品的電泳）；超低溫冰箱（能設(shè)定-80℃）；脫色搖床（能設(shè)定恒定速率搖動）；恒溫培養(yǎng)箱（設(shè)置為37℃）；超凈工作臺；純水儀。高壓滅菌鍋（工作蒸氣壓力0.5MPa）；凝膠成像儀（提供白光和紫外光以及藍(lán)光光源進(jìn)行拍攝凝膠）；水浴鍋（可設(shè)定恒定溫度）；垂直電泳槽（用于蛋白樣品的電泳）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（用于DNA樣品的電泳）；超低溫冰箱（能設(shè)定-80℃）；脫色搖床（能設(shè)定恒定速率搖動）；恒溫培養(yǎng)箱（設(shè)置為37℃）；超凈工作臺；純水儀。A.4特異引物PCR擴增引物見表A.1A.1PCR3基因位點引物序列退火溫度（oC）片段大?。╞p）PRLR基因外顯子9F:5′-CTTACCACAACATTGCTGAC-3′57465R:5′-CCTTGGCTGGATTCTATGG-3′LHβ基因5′非翻譯區(qū)F:5′-ACCAGATCTTGGCCCTTG-3′57291R:5′-CAAAGCCTGAGTCCAAC-3′PCR體系15μL的PCRDNA模板50ng，7.5μlMasterMix，上下游引物(10μM)各0.3μl，加滅菌水至15μl。PCR反應(yīng)條件：955min，9430s5730s，7235s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10m