綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的分子生物學(xué)

及其應(yīng)用綠色熒光蛋白的分子生物學(xué)

及其應(yīng)用2最新綠色熒光蛋白課件3最新綠色熒光蛋白課件4最新綠色熒光蛋白課件5最新綠色熒光蛋白課件6最新綠色熒光蛋白課件7最新綠色熒光蛋白課件8下村修下村修因此成為首位從水母中分離出GFP，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)在紫外光下呈亮綠色的科學(xué)家，他被譽(yù)為生物發(fā)光研究的第一人下村修下村修因此成為首位從水母中分離出GFP，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白91992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。

綠色熒光蛋白的研究史1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析10馬丁·沙爾菲如果說下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則是綠色熒光蛋白的價值發(fā)現(xiàn)者。馬丁·沙爾菲等對實現(xiàn)GFP的基因表達(dá)做出了突出的貢獻(xiàn)他獲獎的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用。馬丁·沙爾菲如果說下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則11

綠色熒光蛋白的研究史1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲中表達(dá)了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。綠色熒光蛋白的研究史1994年Chalfie等12錢永健錢永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的單點突變（S65T）顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，起熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。錢永健的主要貢獻(xiàn)在于利用GFP來追蹤追蹤多種生物細(xì)胞進(jìn)行的生物反應(yīng)，他是這方面公認(rèn)的先驅(qū)。錢永健錢永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他13之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。1997年10月18-22日在美國New-Jersey專門召開了一次關(guān)于GFP的國際會議。

綠色熒光蛋白的研究史之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分142007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得成功。中國首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬成功產(chǎn)下2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬。這是繼美國、韓國、日本之后第四例成功通過體細(xì)胞核移植方式生出的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬。

綠色熒光蛋白的研究史2007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬15綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析16綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP的cDNA編碼區(qū)全長717nt綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP的cDNA編碼區(qū)全17綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP由238aa組成，分子量約27kD綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP由238aa組18綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,蛋白質(zhì)中央是一個罐形結(jié)構(gòu),長420nm,寬240nm,由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成,熒光基團(tuán)的形成就是從這個螺旋開始的,罐的頂部由3個短的垂直片段覆蓋,底部由一個短的垂直片段覆蓋,對熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,19綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析AtopologydiagramofthefoldingpatterninGFP.The-sheetstrandsareshowninlightgreen,a-helicesinblue,andconnectingloopsinyellow.Thepositionsinthesequencethatbeginandendeachmajorsecondarystructureelementarealsogiven.Theanti-parallelstrands(exceptfortheinteractionsbetweenstrands1and6)makeatightlyformedbarrel.綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Atopologyd20ThegreenfluorescentproteinGFPconsistsof238aminoacids,linkedtogetherinalongchain.Thischainfoldsupintotheshapeofabeercan.Insidethebeercanstructuretheaminoacids65,66and67formthechemicalgroupthatabsorbsUVandbluelight,andfluorescesgreen.

綠色熒光蛋白的罐形結(jié)構(gòu)綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Thegreenfluorescent21Thedimercontactregion.Thetwopolypeptidechainsassociateoverabroadarea,withasmallhydrophobicpatch(intheyellowbox)andnumeroushydrophiliccontacts.Thetwo-foldsymmetryaxisisintheplaneofthepage,andismarkedbytheredarrow.Thepolarresiduesaremarkedwithredatomsforoxygenandbluefornitrogen.綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Thedimercontactregi22綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為323綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似，因此為熒光素FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合也適用GFP觀察。盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰，但由于長波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)，特別在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(F24GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。但GFP對某些封片指甲油特別敏感。GFP熒光在pH7.0-12.0穩(wěn)定，在pH5.5-7.0開始受到影響，高溫(>70℃)、極端pH或胍基氯化物條件下，GFP會變性，熒光消失，一旦外界條件恢復(fù)正常，熒光將部分恢復(fù)。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬?5GFP發(fā)色團(tuán)的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形罐頭（藍(lán)色），子鏈的一部分直接從中間穿過（綠色），發(fā)色團(tuán)剛好在罐頭盒的中間，它被保護(hù)起來以免受周圍環(huán)境的影響。這種保護(hù)對于發(fā)射熒光是必需的。一但發(fā)色團(tuán)吸收一個光子，激活的水分子通常就會奪取它的能量。但是在蛋白質(zhì)內(nèi)部改為發(fā)射能量稍低的光子來釋放能量，使它得到了保護(hù)。發(fā)色團(tuán)（右圖）由蛋白質(zhì)鏈上的三個氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和蘇氨酸（或絲氨酸）自發(fā)形成。GFP發(fā)色團(tuán)的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形26綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功于分子內(nèi)第65、66、67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)的功效。綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功27GFP熒光生色團(tuán)

翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,在O2存在下，分子內(nèi)Gly67的酰胺對第Ser65的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基,Tyr66的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這樣,GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán),該過程可以自動催化完成。綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光生色團(tuán)翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,28Stereoviewofthefluorophoreanditsenvironment.His148,Gln94andArg96canbeseenonoppositeendsofthefluorophoreandprobablystabilizeresonantformsofthefluorophore.Charged,polar,andnon-polarsidechainsallcontactthefluorophoreinsomeway.綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)His48Gln94Arg96Stereoviewofthef29ModelofthefluorophoreanditsenvironmentsuperposedontheMAD-phasedelectrondensitymapat2.2?resolution.Thecleardefinitionthroughoutthemapallowedthechaintobetracedandsidechainstobewellplaced.ThedensityforSer65,Tyr66andGly67isquiteconsistentwiththedehydrotyrosine-imidazolidonestructureproposedforthefluorophore.Manyofthesidechainsadjacenttothefluorophorearelabeled.綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)Modelofthefluoropho30

目前對GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，Morise等人曾提出一個能量傳遞模式圖來解釋水母的發(fā)光機(jī)制，但并未獲得認(rèn)同。Chattoaj等對GFP進(jìn)行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出，GFP有兩個明顯的吸收帶，對應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對應(yīng)于395nm的吸收峰，基態(tài)B對應(yīng)于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)(*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A*快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個中間過度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A*轉(zhuǎn)變成I*,I*回遷到基態(tài)I時產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I*轉(zhuǎn)變成B*，由B*到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制目前對GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，Mor31475nm504nm綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制475nm504nm綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制32在離體狀態(tài)下GFP對高溫(70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶除外)有較強(qiáng)抗性GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。GFP的其他生化特性在離體狀態(tài)下GFP對高溫(70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)33GFP作為標(biāo)記蛋白的優(yōu)點①熒光穩(wěn)定②檢測方便③無種屬特異性，也無有細(xì)胞種類和位置的限制④GFP對受體細(xì)胞基本無毒害⑤易于構(gòu)建載體，不受假陽性干擾⑥不需任何反應(yīng)底物和輔助因子⑦可制成永久標(biāo)本⑧靈敏度高GFP作為標(biāo)記蛋白的優(yōu)點①熒光穩(wěn)定②檢測方便③無種屬特異性34GFP基因的改進(jìn)更換GFP生色團(tuán)氨基酸改變堿基組成除去GFP基因中隱蔽剪接位點插人植物內(nèi)含子更換強(qiáng)啟動子等突變體GFP對密碼子進(jìn)行優(yōu)化修飾增加熒光強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，促進(jìn)了生色團(tuán)的折疊GFP基因的改進(jìn)更換GFP生色團(tuán)氨基酸35最新綠色熒光蛋白課件36

Zolotukhin等（1996）改變了wtGFP基因編碼區(qū)中88個密碼子中的92個堿基而用人類基因組中常用的密碼子代替，將GFP的熒光強(qiáng)度提高22倍，適合在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)。人工GFPZolotukhin等（1996）改變了wtGFP基因編37GuohongZhang等（1996）將GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，轉(zhuǎn)染16h~24h后仍可穩(wěn)定地測定熒光。增強(qiáng)型GFPGuohongZhang等（1996）將G38

將wtGFP中的Ser65用Thr替代，得到突變體。S65T-GFP，激發(fā)譜中只有一個峰，且紅移至490nm，用藍(lán)光即可激發(fā)RSFP，使之更適于普通熒光顯微鏡觀察。紅移熒光蛋白將wtGFP中的Ser65用Thr替代，得39

雙突變體Y66H/Y145F能在381nm光的激發(fā)下產(chǎn)生445nm的藍(lán)光，故稱BFP。這種藍(lán)光能進(jìn)一步激發(fā)GFP產(chǎn)生綠光，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET）

。藍(lán)色熒光蛋白雙突變體Y66H/Y145F能在381nm光40EBFP：增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白；ECFP：增強(qiáng)藍(lán)綠色熒光蛋白EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白；EYFP：增強(qiáng)黃色熒光蛋白綠色熒光蛋白變異體的發(fā)色基團(tuán)結(jié)構(gòu)EBFP：增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白；ECFP：增強(qiáng)藍(lán)綠色熒光蛋白綠色41基于GFP的傳感器基于GFP的傳感器42

一種被修飾過的用來感應(yīng)鋅離子濃度的藍(lán)色熒光蛋白：當(dāng)紅色的鋅離子連接到藍(lán)色的被修飾過的發(fā)色團(tuán)上后，蛋白質(zhì)會發(fā)出亮度增強(qiáng)一倍的熒光從而形成容易被檢測到的可見信號。一種被修飾過的用來感應(yīng)鋅離子濃度的藍(lán)色熒光蛋白：43CrystalstructureofaCu-boundgreenfluorescentproteinZnbiosensorCrystalstructureofaZn-boundgreenfluorescentproteinbiosensor鋅離子GFP傳感器CrystalstructureofaCu-boun4488mMFIP-CBSMand88mMCaM(panelsA–C)88mMFIP-CBSMalone(panelsD–F).鈣離子GFP傳感器88mMFIP-CBSMand88mMCaM(p45pHtitrationsofGFPs.(A)FluorescenceandabsorbanceofGFP-S65TasafunctionofpH.DatawerefittedtoEq.1withpKaandnHparametersgiveninthetext.Forcomparison,fluorescencetitrationforfluoresceinisshown(---).(B)FluorescenceofGFP-F64L/S65T,GFP-Y66H,andGFP-T203IasafunctionofpHwithcurvefitsasinA.pH-GFP傳感器pHtitrationsofGFPs.46最新綠色熒光蛋白課件47GFP在生物研究中的應(yīng)用

GFP在生物研究中的應(yīng)用

48GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究

作為報告基因構(gòu)建基因工程載體。以GFPS65T基因作為篩選標(biāo)記的新型克隆載體，以綠白斑篩選法篩選陽性重組子，替代Lacz藍(lán)白斑篩選，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用

HaleC.A.等利用GFP標(biāo)記，研究了可溶性微管蛋白FtsZ與其內(nèi)膜受體ZipA間的相互作用，發(fā)現(xiàn)，ZipA-GFP融合蛋白在細(xì)胞壁溢縮前和溢縮過程中均位于FtsZ與膜相關(guān)的特殊環(huán)中。GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研49GFP作為一種新型免疫標(biāo)記物

利用GFP的發(fā)光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀察，可望取代傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)，建立特異、靈敏、簡便和快速的免疫診斷新方法。岳莉莉等成功地實現(xiàn)了gfp與HBVe抗原基因融合后在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發(fā)光免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為一種新型免疫標(biāo)記物GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用50GFP在植物研究中的應(yīng)用作為報告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究

GFP作為新型報告基因用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，可以替代與篩選有關(guān)的抗生素或抗除草劑標(biāo)記基因，既優(yōu)化植物遺傳轉(zhuǎn)化過程，又使轉(zhuǎn)基因植物更安全。用于植物基因表達(dá)調(diào)控研究

基因的表達(dá)可進(jìn)行活體檢測，利用GFP基因可以很方便地研究基因表達(dá)的時空性。Aspuria等(2002)將GFP與受生長素誘導(dǎo)的啟動子重組后導(dǎo)入植物，用生長素誘導(dǎo)后，通過觀察側(cè)根的分生組織中是否有GFP的積累來證明生長素的時空表達(dá)。GFP在植物研究中的應(yīng)用作為報告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究51Thephotographwastaken6dayspost-inoculationusingaDRHandLamp.Thegreenfluorescentspots(againstabackgroundofredchlorophyllfluorescence)showtheexpandingfociofvirus-infectedcells.病毒介導(dǎo)的EGFP在煙草中的表達(dá)Thephotographwastak52RNAsilencingofgreenfluorescentprotein(GFP)(center)inleavesfromNicotianabenthamianaissuppressedbyananimal(left;B2proteinofflockhousevirus)oraplant(right)viralsuppressor,leadingtoenhancedGFPexpression(lightergreen/yellowareas).GFP用于植物RNA沉默研究RNAsilencingofgreen53用于植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

GFP結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FREP)為研究植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也提供了新方法。例如：Allen等用YEP-GFP-Ca2+

傳感器檢測擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+

濃度的變化，結(jié)果表明，外源的Ca2+

和ABA都能引起保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。這和過去用熒光染色法觀察到的結(jié)果一致。GFP在植物研究中的應(yīng)用用于植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究GFP在植物研究中的應(yīng)用54GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP用于微生物與宿主相互作用研究利用GFP標(biāo)記基因可以研究病毒、細(xì)菌和真菌等侵染植物的過程和機(jī)制。Bowyer等在小麥病原菌中構(gòu)建了含異檸檬酸酶啟動子的GFP基因，監(jiān)測到T.yallundae侵染小麥時的碳代謝過程。GFP用于檢測環(huán)境微生物的遷移

Leff等將GFP克隆到基因工程菌中,監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。Scott等以GFP紅移突變體作為標(biāo)記基因,有效地追蹤了乳酸細(xì)菌在復(fù)雜厭氧系統(tǒng)中的運(yùn)移。GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP用于微生物與宿主相互作用研究55GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP微生物傳感器

將報告基因轉(zhuǎn)入污染物代謝基因的啟動子中可設(shè)計出生物傳感器,當(dāng)特定的污染物存在時即啟動。Ikeno等分別以GFP和Ps作為報告基因和啟動子，轉(zhuǎn)入E.coli重組子中，用以檢測水體中微量的苯衍生物。Roberto等以GFP作為報告基因，設(shè)計出可檢測環(huán)境中亞微克級含量的砷和砷酸鹽的生物傳感器。GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP微生物傳感器56Moller等研究發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的P.putidaRI細(xì)菌主要聚集在生物膜的表層，而Acinetobactersp.C6則附著在生物膜底層生長。研究生物膜的生長特性及其菌落特性C6:redR1:blueMoller等研究發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的P.57GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP在真菌研究中的應(yīng)用

（1）GFP基因通過隨機(jī)插入真菌基因組的方法,已經(jīng)被成功地用來研究真菌的生態(tài)、生防菌對病原菌的侵染模式及病原菌與其寄主的關(guān)系等（2）GFP基因通過與目標(biāo)基因融合的方法,則被廣泛地用于真菌的基因轉(zhuǎn)錄規(guī)則、蛋白質(zhì)及細(xì)胞器定位、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能等研究.GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP在真菌研究中的應(yīng)用58GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用藥物篩選利用GFP熒光探針，從數(shù)量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號分子相似的，能引起配體-受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能。如介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體（hGR)遷移藥物的篩選模型的成功構(gòu)建。用于臨床檢驗示蹤病原菌

GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用藥物篩選59GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用

GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用60GFP在蛋白質(zhì)細(xì)胞定位中的應(yīng)用GFP在蛋白質(zhì)細(xì)胞定位中的應(yīng)用61最新綠色熒光蛋白課件62Animageofasinglemamaliancellwithgreen-to-redfluorescentDendramarkingfibrillarin,aproteinconcentratedinnucleoli,whicharesmall,roundbodiesinthecell'snucleus,composedofproteinandRNA.Animageofasinglem63科學(xué)使用綠色熒光蛋白跟蹤大腦細(xì)胞的活動科學(xué)使用綠色熒光蛋白跟蹤大腦細(xì)胞的活動64

隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷擴(kuò)散，通過跟蹤發(fā)出的綠光就可觀察病毒的擴(kuò)散途徑；或者把它接合到一種蛋白質(zhì)上并通過顯微鏡觀察它在細(xì)胞內(nèi)部的移動。隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷擴(kuò)散，通過跟蹤發(fā)出的綠65a.線粒體；b.肌動蛋白；c.微管蛋白d.高爾基體；e.紐蛋白；f.組蛋白a.線粒體；b.肌動蛋白；c.微管蛋白66LocalisationoftheERtargetedformofGFP

LocalisationoftheERtargete67RootsfromArabidopsisplantstransformedwithaconstructcontaining

thecyclinB1;1promoter,cyclinB1;1genefusedtoGFP.

CellsfluorescingingreenareinmitosisRootsfromArabidopsisplants68GFP轉(zhuǎn)基因生物GFP轉(zhuǎn)基因生物69發(fā)綠光的老鼠1997年7月日本大阪大學(xué)的科研人員首次培育出能夠夜里發(fā)光的含有綠色熒光蛋白的老鼠。發(fā)綠光的老鼠1997年7月日本大阪大學(xué)的科研701998年，EduardoKac通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出第一條可以發(fā)出綠色熒光的狗。發(fā)綠光的狗1998年，EduardoKac通過轉(zhuǎn)基因71轉(zhuǎn)GFP基因的蜜蜂轉(zhuǎn)GFP基因的蜜蜂72轉(zhuǎn)GFP基因的蠑螈（斑馬魚）

轉(zhuǎn)GFP基因的蠑螈（斑馬魚）73

轉(zhuǎn)GFP基因的兔子轉(zhuǎn)GFP基因的兔子74GFP基因在蛾子的眼部表達(dá)GFP基因在蛾子的眼部表達(dá)75

2004年7月12日韓國科學(xué)家成功培育出身體可發(fā)出熒光的轉(zhuǎn)基因雞。發(fā)熒光的雞2004年7月12日韓國科學(xué)家成功培育出身體可76發(fā)紅光的貓

韓國科學(xué)家采用基因工程技術(shù)克隆的“熒光貓”2007年登上世界各大媒體的頭條新聞。一旦暴露在紫外光線下，這種克隆貓就能發(fā)紅色的熒光。發(fā)紅光的貓韓國科學(xué)家采用基因工程技術(shù)克隆的“77我國首例熒光轉(zhuǎn)基因克隆豬產(chǎn)下熒光豬崽

2007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得成功。中國首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬成功產(chǎn)下2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬。我國首例熒光轉(zhuǎn)基因克隆豬產(chǎn)下熒光豬崽200778中國第一例轉(zhuǎn)基因猴子在昆明落地南方都市報發(fā)布時間：2010-11-1208:31中國第一例轉(zhuǎn)基因猴子在昆明落地南方都市報發(fā)布時間：20179Theheadofabarleyplanttransformedwithageneforgreenfluorescentprotein(GFP)usingthegenegun.(Theredheadisuntransformed;thegreenheadistransformed)基因槍介導(dǎo)的GFP在小麥中的表達(dá)Theheadofabarleyp80GFPcanola(left)withawild-typeplant(right)underUVlight.發(fā)綠光的油菜GFPcanola(left)withawild-81“藝術(shù)”中的GFP調(diào)色板“藝術(shù)”中的GFP調(diào)色板82BacterialcolonyusingvariousGFPandGFP-likeproteins(fromTsienlabWebsite).錢永健實驗室

Bacterialcolonyusing83細(xì)胞里的彩虹

用產(chǎn)生不同顏色熒光蛋白的細(xì)菌創(chuàng)作的圖畫細(xì)胞里的彩虹用產(chǎn)生不同顏色熒光蛋白的細(xì)菌創(chuàng)作的圖畫84

科學(xué)家用九十多種顏色的熒光蛋白“標(biāo)記”的小鼠大腦中神經(jīng)細(xì)胞就像一個個五顏六色的風(fēng)箏，又像彩虹。大腦里的彩虹科學(xué)家用九十多種顏色的熒光蛋白“標(biāo)記”的小鼠大腦中神85

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，像這些星細(xì)胞，重點照顧思考神經(jīng)元的身體，包括飲食和保護(hù)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，像這些星細(xì)胞，重點照顧思考神經(jīng)元的身體86大腦彩虹圖象抽象畫

此混雜又濃密的神經(jīng)元位于腦干的聽覺區(qū)

大腦彩虹圖象抽象畫此混雜又濃密的神經(jīng)元位于腦干的聽87

這些位于大腦皮層的神經(jīng)元就是通常所說的大腦灰質(zhì)，參與思考和各種感覺。

此細(xì)胞圖像正在向小腦傳送信息，告訴它肌肉要怎么做這些位于大腦皮層的神經(jīng)元就是通常所說的大腦灰質(zhì)，參與88

一個腦干神經(jīng)元（紅色）被來自其它神經(jīng)元的殘余信號（藍(lán)黃色）所包圍大腦彩虹圖展示神經(jīng)活動一個腦干神經(jīng)元（紅色）被來自其它神經(jīng)元的殘余89美國哈佛大學(xué)分子與細(xì)胞生物學(xué)教授杰夫·李其曼在其顯微鏡前大腦里的彩虹美國哈佛大學(xué)分子與細(xì)胞生物學(xué)教授杰夫·李其曼在其顯微鏡前大90綠色熒光蛋白為什么重要？錢永健如是說在追蹤細(xì)胞內(nèi)移動的分子上，綠色熒光蛋白是非常方便的「道具」，有助于追蹤腦神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程及癌細(xì)胞的擴(kuò)散情況，一舉一動都逃不過科學(xué)家的眼睛，這回拿下諾貝爾獎，也象征醫(yī)學(xué)科技又向前邁進(jìn)一大步。綠色熒光蛋白為什么重要？錢永健如是說91謝謝！謝謝！92最新綠色熒光蛋白課件93

結(jié)束語謝謝大家聆聽！??！94

結(jié)束語謝謝大家聆聽?。?！94綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的分子生物學(xué)

及其應(yīng)用綠色熒光蛋白的分子生物學(xué)

及其應(yīng)用96最新綠色熒光蛋白課件97最新綠色熒光蛋白課件98最新綠色熒光蛋白課件99最新綠色熒光蛋白課件100最新綠色熒光蛋白課件101最新綠色熒光蛋白課件102下村修下村修因此成為首位從水母中分離出GFP，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)在紫外光下呈亮綠色的科學(xué)家，他被譽(yù)為生物發(fā)光研究的第一人下村修下村修因此成為首位從水母中分離出GFP，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白1031992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。

綠色熒光蛋白的研究史1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析104馬丁·沙爾菲如果說下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則是綠色熒光蛋白的價值發(fā)現(xiàn)者。馬丁·沙爾菲等對實現(xiàn)GFP的基因表達(dá)做出了突出的貢獻(xiàn)他獲獎的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用。馬丁·沙爾菲如果說下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則105

綠色熒光蛋白的研究史1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲中表達(dá)了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。綠色熒光蛋白的研究史1994年Chalfie等106錢永健錢永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的單點突變（S65T）顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，起熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。錢永健的主要貢獻(xiàn)在于利用GFP來追蹤追蹤多種生物細(xì)胞進(jìn)行的生物反應(yīng)，他是這方面公認(rèn)的先驅(qū)。錢永健錢永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他107之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。1997年10月18-22日在美國New-Jersey專門召開了一次關(guān)于GFP的國際會議。

綠色熒光蛋白的研究史之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分1082007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得成功。中國首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬成功產(chǎn)下2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬。這是繼美國、韓國、日本之后第四例成功通過體細(xì)胞核移植方式生出的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬。

綠色熒光蛋白的研究史2007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬109綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析110綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP的cDNA編碼區(qū)全長717nt綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP的cDNA編碼區(qū)全111綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP由238aa組成，分子量約27kD綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母GFP由238aa組112綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,蛋白質(zhì)中央是一個罐形結(jié)構(gòu),長420nm,寬240nm,由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成,熒光基團(tuán)的形成就是從這個螺旋開始的,罐的頂部由3個短的垂直片段覆蓋,底部由一個短的垂直片段覆蓋,對熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,113綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析AtopologydiagramofthefoldingpatterninGFP.The-sheetstrandsareshowninlightgreen,a-helicesinblue,andconnectingloopsinyellow.Thepositionsinthesequencethatbeginandendeachmajorsecondarystructureelementarealsogiven.Theanti-parallelstrands(exceptfortheinteractionsbetweenstrands1and6)makeatightlyformedbarrel.綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Atopologyd114ThegreenfluorescentproteinGFPconsistsof238aminoacids,linkedtogetherinalongchain.Thischainfoldsupintotheshapeofabeercan.Insidethebeercanstructuretheaminoacids65,66and67formthechemicalgroupthatabsorbsUVandbluelight,andfluorescesgreen.

綠色熒光蛋白的罐形結(jié)構(gòu)綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Thegreenfluorescent115Thedimercontactregion.Thetwopolypeptidechainsassociateoverabroadarea,withasmallhydrophobicpatch(intheyellowbox)andnumeroushydrophiliccontacts.Thetwo-foldsymmetryaxisisintheplaneofthepage,andismarkedbytheredarrow.Thepolarresiduesaremarkedwithredatomsforoxygenandbluefornitrogen.綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析Thedimercontactregi116綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為3117綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似，因此為熒光素FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合也適用GFP觀察。盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰，但由于長波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)，特別在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(F118GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。但GFP對某些封片指甲油特別敏感。GFP熒光在pH7.0-12.0穩(wěn)定，在pH5.5-7.0開始受到影響，高溫(>70℃)、極端pH或胍基氯化物條件下，GFP會變性，熒光消失，一旦外界條件恢復(fù)正常，熒光將部分恢復(fù)。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬?19GFP發(fā)色團(tuán)的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形罐頭（藍(lán)色），子鏈的一部分直接從中間穿過（綠色），發(fā)色團(tuán)剛好在罐頭盒的中間，它被保護(hù)起來以免受周圍環(huán)境的影響。這種保護(hù)對于發(fā)射熒光是必需的。一但發(fā)色團(tuán)吸收一個光子，激活的水分子通常就會奪取它的能量。但是在蛋白質(zhì)內(nèi)部改為發(fā)射能量稍低的光子來釋放能量，使它得到了保護(hù)。發(fā)色團(tuán)（右圖）由蛋白質(zhì)鏈上的三個氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和蘇氨酸（或絲氨酸）自發(fā)形成。GFP發(fā)色團(tuán)的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形120綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功于分子內(nèi)第65、66、67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)的功效。綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功121GFP熒光生色團(tuán)

翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,在O2存在下，分子內(nèi)Gly67的酰胺對第Ser65的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基,Tyr66的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這樣,GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán),該過程可以自動催化完成。綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)GFP熒光生色團(tuán)翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,122Stereoviewofthefluorophoreanditsenvironment.His148,Gln94andArg96canbeseenonoppositeendsofthefluorophoreandprobablystabilizeresonantformsofthefluorophore.Charged,polar,andnon-polarsidechainsallcontactthefluorophoreinsomeway.綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)His48Gln94Arg96Stereoviewofthef123ModelofthefluorophoreanditsenvironmentsuperposedontheMAD-phasedelectrondensitymapat2.2?resolution.Thecleardefinitionthroughoutthemapallowedthechaintobetracedandsidechainstobewellplaced.ThedensityforSer65,Tyr66andGly67isquiteconsistentwiththedehydrotyrosine-imidazolidonestructureproposedforthefluorophore.Manyofthesidechainsadjacenttothefluorophorearelabeled.綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)Modelofthefluoropho124

目前對GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，Morise等人曾提出一個能量傳遞模式圖來解釋水母的發(fā)光機(jī)制，但并未獲得認(rèn)同。Chattoaj等對GFP進(jìn)行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出，GFP有兩個明顯的吸收帶，對應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對應(yīng)于395nm的吸收峰，基態(tài)B對應(yīng)于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)(*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A*快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個中間過度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A*轉(zhuǎn)變成I*,I*回遷到基態(tài)I時產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I*轉(zhuǎn)變成B*，由B*到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制目前對GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，Mor125475nm504nm綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制475nm504nm綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制126在離體狀態(tài)下GFP對高溫(70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶除外)有較強(qiáng)抗性GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。GFP的其他生化特性在離體狀態(tài)下GFP對高溫(70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)127GFP作為標(biāo)記蛋白的優(yōu)點①熒光穩(wěn)定②檢測方便③無種屬特異性，也無有細(xì)胞種類和位置的限制④GFP對受體細(xì)胞基本無毒害⑤易于構(gòu)建載體，不受假陽性干擾⑥不需任何反應(yīng)底物和輔助因子⑦可制成永久標(biāo)本⑧靈敏度高GFP作為標(biāo)記蛋白的優(yōu)點①熒光穩(wěn)定②檢測方便③無種屬特異性128GFP基因的改進(jìn)更換GFP生色團(tuán)氨基酸改變堿基組成除去GFP基因中隱蔽剪接位點插人植物內(nèi)含子更換強(qiáng)啟動子等突變體GFP對密碼子進(jìn)行優(yōu)化修飾增加熒光強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，促進(jìn)了生色團(tuán)的折疊GFP基因的改進(jìn)更換GFP生色團(tuán)氨基酸129最新綠色熒光蛋白課件130

Zolotukhin等（1996）改變了wtGFP基因編碼區(qū)中88個密碼子中的92個堿基而用人類基因組中常用的密碼子代替，將GFP的熒光強(qiáng)度提高22倍，適合在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)。人工GFPZolotukhin等（1996）改變了wtGFP基因編131GuohongZhang等（1996）將GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，轉(zhuǎn)染16h~24h后仍可穩(wěn)定地測定熒光。增強(qiáng)型GFPGuohongZhang等（1996）將G132

將wtGFP中的Ser65用Thr替代，得到突變體。S65T-GFP，激發(fā)譜中只有一個峰，且紅移至490nm，用藍(lán)光即可激發(fā)RSFP，使之更適于普通熒光顯微鏡觀察。紅移熒光蛋白將wtGFP中的Ser65用Thr替代，得133

雙突變體Y66H/Y145F能在381nm光的激發(fā)下產(chǎn)生445nm的藍(lán)光，故稱BFP。這種藍(lán)光能進(jìn)一步激發(fā)GFP產(chǎn)生綠光，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET）

。藍(lán)色熒光蛋白雙突變體Y66H/Y145F能在381nm光134EBFP：增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白；ECFP：增強(qiáng)藍(lán)綠色熒光蛋白EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白；EYFP：增強(qiáng)黃色熒光蛋白綠色熒光蛋白變異體的發(fā)色基團(tuán)結(jié)構(gòu)EBFP：增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白；ECFP：增強(qiáng)藍(lán)綠色熒光蛋白綠色135基于GFP的傳感器基于GFP的傳感器136

一種被修飾過的用來感應(yīng)鋅離子濃度的藍(lán)色熒光蛋白：當(dāng)紅色的鋅離子連接到藍(lán)色的被修飾過的發(fā)色團(tuán)上后，蛋白質(zhì)會發(fā)出亮度增強(qiáng)一倍的熒光從而形成容易被檢測到的可見信號。一種被修飾過的用來感應(yīng)鋅離子濃度的藍(lán)色熒光蛋白：137CrystalstructureofaCu-boundgreenfluorescentproteinZnbiosensorCrystalstructureofaZn-boundgreenfluorescentproteinbiosensor鋅離子GFP傳感器CrystalstructureofaCu-boun13888mMFIP-CBSMand88mMCaM(panelsA–C)88mMFIP-CBSMalone(panelsD–F).鈣離子GFP傳感器88mMFIP-CBSMand88mMCaM(p139pHtitrationsofGFPs.(A)FluorescenceandabsorbanceofGFP-S65TasafunctionofpH.DatawerefittedtoEq.1withpKaandnHparametersgiveninthetext.Forcomparison,fluorescencetitrationforfluoresceinisshown(---).(B)FluorescenceofGFP-F64L/S65T,GFP-Y66H,andGFP-T203IasafunctionofpHwithcurvefitsasinA.pH-GFP傳感器pHtitrationsofGFPs.140最新綠色熒光蛋白課件141GFP在生物研究中的應(yīng)用

GFP在生物研究中的應(yīng)用

142GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究

作為報告基因構(gòu)建基因工程載體。以GFPS65T基因作為篩選標(biāo)記的新型克隆載體，以綠白斑篩選法篩選陽性重組子，替代Lacz藍(lán)白斑篩選，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用

HaleC.A.等利用GFP標(biāo)記，研究了可溶性微管蛋白FtsZ與其內(nèi)膜受體ZipA間的相互作用，發(fā)現(xiàn)，ZipA-GFP融合蛋白在細(xì)胞壁溢縮前和溢縮過程中均位于FtsZ與膜相關(guān)的特殊環(huán)中。GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研143GFP作為一種新型免疫標(biāo)記物

利用GFP的發(fā)光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀察，可望取代傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)，建立特異、靈敏、簡便和快速的免疫診斷新方法。岳莉莉等成功地實現(xiàn)了gfp與HBVe抗原基因融合后在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發(fā)光免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為一種新型免疫標(biāo)記物GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用144GFP在植物研究中的應(yīng)用作為報告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究

GFP作為新型報告基因用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，可以替代與篩選有關(guān)的抗生素或抗除草劑標(biāo)記基因，既優(yōu)化植物遺傳轉(zhuǎn)化過程，又使轉(zhuǎn)基因植物更安全。用于植物基因表達(dá)調(diào)控研究

基因的表達(dá)可進(jìn)行活體檢測，利用GFP基因可以很方便地研究基因表達(dá)的時空性。Aspuria等(2002)將GFP與受生長素誘導(dǎo)的啟動子重組后導(dǎo)入植物，用生長素誘導(dǎo)后，通過觀察側(cè)根的分生組織中是否有GFP的積累來證明生長素的時空表達(dá)。GFP在植物研究中的應(yīng)用作為報告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究145Thephotographwastaken6dayspost-inoculationusingaDRHandLamp.Thegreenfluorescentspots(againstabackgroundofredchlorophyllfluorescence)showtheexpandingfociofvirus-infectedcells.病毒介導(dǎo)的EGFP在煙草中的表達(dá)Thephotographwastak146RNAsilencingofgreenfluorescentprotein(GFP)(center)inleavesfromNicotianabenthamianaissuppressedbyananimal(left;B2proteinofflockhousevirus)oraplant(right)viralsuppressor,leadingtoenhancedGFPexpression(lightergreen/yellowareas).GFP用于植物RNA沉默研究RNAsilencingofgreen147用于植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

GFP結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FREP)為研究植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也提供了新方法。例如：Allen等用YEP-GFP-Ca2+

傳感器檢測擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+

濃度的變化，結(jié)果表明，外源的Ca2+

和ABA都能引起保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。這和過去用熒光染色法觀察到的結(jié)果一致。GFP在植物研究中的應(yīng)用用于植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究GFP在植物研究中的應(yīng)用148GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP用于微生物與宿主相互作用研究利用GFP標(biāo)記基因可以研究病毒、細(xì)菌和真菌等侵染植物的過程和機(jī)制。Bowyer等在小麥病原菌中構(gòu)建了含異檸檬酸酶啟動子的GFP基因，監(jiān)測到T.yallundae侵染小麥時的碳代謝過程。GFP用于檢測環(huán)境微生物的遷移

Leff等將GFP克隆到基因工程菌中,監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。Scott等以GFP紅移突變體作為標(biāo)記基因,有效地追蹤了乳酸細(xì)菌在復(fù)雜厭氧系統(tǒng)中的運(yùn)移。GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP用于微生物與宿主相互作用研究149GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP微生物傳感器

將報告基因轉(zhuǎn)入污染物代謝基因的啟動子中可設(shè)計出生物傳感器,當(dāng)特定的污染物存在時即啟動。Ikeno等分別以GFP和Ps作為報告基因和啟動子，轉(zhuǎn)入E.coli重組子中，用以檢測水體中微量的苯衍生物。Roberto等以GFP作為報告基因，設(shè)計出可檢測環(huán)境中亞微克級含量的砷和砷酸鹽的生物傳感器。GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP微生物傳感器150Moller等研究發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的P.putidaRI細(xì)菌主要聚集在生物膜的表層，而Acinetobactersp.C6則附著在生物膜底層生長。研究生物膜的生長特性及其菌落特性C6:redR1:blueMoller等研究發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的P.151GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP在真菌研究中的應(yīng)用

（1）GFP基因通過隨機(jī)插入真菌基因組的方法,已經(jīng)被成功地用來研究真菌的生態(tài)、生防菌對病原菌的侵染模式及病原菌與其寄主的關(guān)系等（2）GFP基因通過與目標(biāo)基因融合的方法,則被廣泛地用于真菌的基因轉(zhuǎn)錄規(guī)則、蛋白質(zhì)及細(xì)胞器定位、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能等研究.GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP在真菌研究中的應(yīng)用152GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用藥物篩選利用GFP熒光探針，從數(shù)量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號分子相似的，能引起配體-受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能。如介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體（hGR)遷移藥物的篩選模型的成功構(gòu)建。用于臨床檢驗示蹤病原菌

GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用藥物篩選153GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用

GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用154GFP在蛋白質(zhì)細(xì)胞定位中的應(yīng)用GFP在蛋白質(zhì)細(xì)胞定位中的應(yīng)用155最新綠色熒光蛋白課件156Animageofasinglemamaliancellwithgreen-to-redfluorescentDendramarkingfibrillarin,aproteinconcentratedinnucleoli,whicharesmall,roundbodiesinthecell'snucleus,composedofproteinandRNA.Animageofasin