蛋白質(zhì)核酸DNARNA元素組成C、H、O、N和S其中N含量基本恒定，約占16%。C、H、O、N和P基本單位氨基酸核苷酸結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸的排列順序肽鍵和二硫鍵核苷酸的排列順序磷酸二酯鍵mRNA:5-帽狀結(jié)構(gòu)和3-polyA尾巴二級(jí)結(jié)構(gòu)主鏈的局部空間構(gòu)象改變，基礎(chǔ)：肽平面或肽單位。四種構(gòu)象：α螺旋、Β折疊、Β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲氫鍵超二級(jí)結(jié)構(gòu)：motif雙螺旋結(jié)構(gòu)與α螺旋結(jié)構(gòu)有共同之處tRNA三葉草結(jié)構(gòu)：反密碼環(huán)和氨基酸側(cè)臂rRNA葉狀結(jié)構(gòu)·三級(jí)結(jié)構(gòu)全部的空間構(gòu)象改變次級(jí)鍵：氫鍵、疏水作用、鹽鍵、范德華力代表：肌紅蛋白超三級(jí)結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)域染色體形成tRNAL型結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)亞基+亞基次級(jí)鍵，以疏水作用為主代表：血紅蛋白理化性質(zhì)兩性解離、呈色效應(yīng)、紫外吸收、膠體性質(zhì)（蛋白質(zhì)）變性和復(fù)性、呈色效應(yīng)、紫外吸收分離和檢測(cè)分離和純化、westernbloting、等電聚焦、雙向電泳分離和純化、northernbloting、PCR蛋白質(zhì)核酸DNARNA元素組成C、H、O、N和SC、H、O、第10章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)第10章DNA的生物合成復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈D本章主要內(nèi)容：

復(fù)制的基本規(guī)律

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

DNA損傷（突變）與修復(fù)本章主要內(nèi)容：復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativ一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開(kāi)為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念:一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征DNA生物合成時(shí)，母鏈AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子代DNAATCGATTAATAT+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子密度梯度實(shí)驗(yàn):——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果密度梯度實(shí)驗(yàn):——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-D子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:全保留式按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸形成雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖像原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)

。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’三、DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)三、DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制3順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(laggingstrand)

。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationDNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymol參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫(xiě)為DNA-pol；模板(template):

解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):dAT一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(d聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3方向進(jìn)行。聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需引物和模板；二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性:5′AGCTTCAG（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠ原核生物的DNA聚合酶原核生物的DNA聚合酶功能：DNA-polⅠ（109kD）對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。功能：DNA-polⅠ（109kD）對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延（二）常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol（二）常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種DNA-pol起始真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來(lái)保證復(fù)制的保真性。三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)（一）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來(lái)的酶，外切酶是有方向性的。（一）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正核酸外A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNApolⅠ的校讀功能A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻（二）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

（二）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)E.Coli基因圖E.Coli基因圖解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵108局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈復(fù)制過(guò)程正超螺旋的形成：108局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)拓?fù)涿傅淖饔梅绞剑和負(fù)涿傅淖饔梅绞剑何濉NA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式：五、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3-HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶的作用：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。功能：提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長(zhǎng)中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓?fù)涿盖袛?、整理后的兩鏈改變拓?fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較

提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長(zhǎng)中的DNA生物合成過(guò)程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開(kāi)成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.DNA解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。DnaADnaB、DnaCDNA3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件（二）復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

（二）復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTP領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。隨從鏈的合成隨從鏈的合成同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長(zhǎng)同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長(zhǎng)階段一階段二階段三階段四階段一階段二階段三階段四復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復(fù)制的終止過(guò)程：切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP5第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DN真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。

復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物－模板鏈；并且PCNA使polδ獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuc細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclindependentkinase，CDK)。

細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及GCDK相匹配的周期蛋白作用點(diǎn)CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1→S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2→M期哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和CDKCDK相匹配的周期蛋白作用點(diǎn)CDK2CyclinD1,D哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使細(xì)胞周期開(kāi)放/關(guān)閉，因此被形容為細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)(checkpoint)蛋白。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(aDNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-polδ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。（二）真核生物復(fù)制的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換DNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體真核生物復(fù)制叉的延長(zhǎng)：3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。（三）端粒酶參與解決染色53355335+533335553355335+5333355第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件切除引物的兩種機(jī)制切除引物的兩種機(jī)制線性DNA復(fù)制的末端線性DNA復(fù)制的末端端粒(telomere)

指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成：端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humant端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式第四節(jié)雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。少數(shù)低等生物如M13噬菌體，它的感染型只含單鏈DNA。原核生物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進(jìn)行復(fù)制。雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RRNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立繁殖。在某些情況下，前病毒基因組通過(guò)基因重組(recombination)，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達(dá)。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨(dú)立繁殖或整合，都可成為致病的原因。RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)三、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制和線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplicati3-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5dNTPDNA-polγD環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。

dNTPDNA-polγD環(huán)復(fù)制(D-loopreplD-環(huán)復(fù)制時(shí)需合成引物。mtDNA為雙鏈，第一個(gè)引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸。至第二個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)時(shí)，又合成另一個(gè)反向引物，以外環(huán)為模板進(jìn)行反向的延伸。最后完成兩個(gè)雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制。復(fù)制中呈字母D形狀而得名。D環(huán)復(fù)制的特點(diǎn)是復(fù)制起始點(diǎn)不在雙鏈DNA同一位點(diǎn)，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時(shí)序差別。D-環(huán)復(fù)制時(shí)需合成引物。mtDNA為雙鏈，第一個(gè)引物以內(nèi)環(huán)為DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)&Repair第五節(jié)DNA損傷（突變）與修復(fù)第五節(jié)DNA突變具體指?jìng)€(gè)別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。DNA突變具體指?jìng)€(gè)別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或一、突變?cè)谏锝缙毡榇嬖冢ㄒ唬┩蛔兪沁M(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)從長(zhǎng)遠(yuǎn)的生物史看，進(jìn)化過(guò)程是突變的不斷發(fā)生所造成的。大量的突變都是屬于這種類型，只是目前還未能認(rèn)識(shí)其發(fā)生的真正原因，因而名為自發(fā)突變或自然突變(spontaneousmutation)。一、突變?cè)谏锝缙毡榇嬖冢ㄒ唬┩蛔兪沁M(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)從長(zhǎng)（二）只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性這種突變沒(méi)有可察覺(jué)的表型改變，例如在簡(jiǎn)并密碼子上第三位堿基的改變，蛋白質(zhì)非功能區(qū)段上編碼序列的改變等。這些現(xiàn)象也相當(dāng)普遍。多態(tài)性(polymorphism)一詞用來(lái)描述個(gè)體之間的基因型差別現(xiàn)象。（二）只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性這種突變沒(méi)有可察（三）致死性的突變可導(dǎo)致個(gè)體、細(xì)胞的死亡

（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（三）致死性的突變可導(dǎo)致個(gè)體、細(xì)胞的死亡二、多種化學(xué)或物理因素可誘發(fā)突變大量的突變屬于自發(fā)突變，發(fā)生頻率只不過(guò)在10-9左右。但由于生物基因組龐大，細(xì)胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。實(shí)驗(yàn)室用來(lái)誘發(fā)突變，也是生活環(huán)境中導(dǎo)致突變的因素，主要有物理和化學(xué)因素。二、多種化學(xué)或物理因素可誘發(fā)突變大量的突變屬于自發(fā)突變，發(fā)生物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻化學(xué)因素：化學(xué)因素：三、引起突變的分子改變類型有多種錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

三、引起突變的分子改變類型有多種錯(cuò)配(mismatch)框DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation)。自發(fā)突變和不少化學(xué)誘變都能引起DNA上某一堿基的置換。點(diǎn)突變發(fā)生在基因的編碼區(qū)，可導(dǎo)致氨基酸改變。（一）錯(cuò)配可導(dǎo)致編碼氨基酸的改變DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因鐮形紅細(xì)胞貧血病人鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val·h圖10-29膀胱癌細(xì)胞c-rasH基因點(diǎn)突變，基因表達(dá)產(chǎn)物僅12號(hào)氨基酸的變異圖10-29膀胱癌細(xì)胞c-rasH基因點(diǎn)突變，基因表達(dá)產(chǎn)物（二）缺失、插入和框移突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變?nèi)笔В阂粋€(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來(lái)沒(méi)有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。（二）缺失、插入和框移突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變?nèi)惫壤业敖z5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變：谷酪蛋（三）重組或重排常可引起遺傳、腫瘤等疾病DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。移位的DNA可以在新位點(diǎn)上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體之間發(fā)生交換重組。（三）重組或重排?？梢疬z傳、腫瘤等疾病DNA分子內(nèi)較大片段由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型：由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型：DNA損傷（突變）可能造成兩種結(jié)果：其一是導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙（如胸腺嘧啶二聚體，DNA骨架中產(chǎn)生切口或斷裂）；其二是導(dǎo)致復(fù)制后基因突變（如胞嘧啶自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?，使DNA序列發(fā)生永久性改變。所以，必須通過(guò)進(jìn)化使細(xì)胞擁有靈敏的機(jī)制，以識(shí)別和修復(fù)這些損傷，否則細(xì)胞無(wú)法維持正常代謝。DNA損傷（突變）可能造成兩種結(jié)果：其一是導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙四、DNA損傷的修復(fù)有多種類型修復(fù)(repairing)是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)直接修復(fù)(directrepair)光修復(fù)(lightrepairing)切除修復(fù)(excisionrepairing)重組修復(fù)(recombinationrepairing)SOS修復(fù)

修復(fù)的主要類型：四、DNA損傷的修復(fù)有多種類型修復(fù)(repairing)是對(duì)（一）直接修復(fù)系統(tǒng)利用酶簡(jiǎn)單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光修復(fù)酶(photolyase)

UV（一）直接修復(fù)系統(tǒng)利用酶簡(jiǎn)單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光修復(fù)酶(pho（二）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋變形這是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)方式。其過(guò)程包括去除損傷的DNA，填補(bǔ)空隙和連接。主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。（二）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋變形這是細(xì)胞內(nèi)最重要UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATPE.coli的切除修復(fù)機(jī)制UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接核苷酸切除修復(fù)不僅能夠修復(fù)整個(gè)基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，即參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(transcription-coupledrepair)。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的意義在于，將修復(fù)酶集中于正在轉(zhuǎn)錄的DNA，使該區(qū)域的損傷盡快得以修復(fù)。核苷酸切除修復(fù)不僅能夠修復(fù)整個(gè)基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)（三）重組修復(fù)（三）重組修復(fù)（四）SOS修復(fù)當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過(guò)SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。（四）SOS修復(fù)當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出蛋白質(zhì)核酸DNARNA元素組成C、H、O、N和S其中N含量基本恒定，約占16%。C、H、O、N和P基本單位氨基酸核苷酸結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸的排列順序肽鍵和二硫鍵核苷酸的排列順序磷酸二酯鍵mRNA:5-帽狀結(jié)構(gòu)和3-polyA尾巴二級(jí)結(jié)構(gòu)主鏈的局部空間構(gòu)象改變，基礎(chǔ)：肽平面或肽單位。四種構(gòu)象：α螺旋、Β折疊、Β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲氫鍵超二級(jí)結(jié)構(gòu)：motif雙螺旋結(jié)構(gòu)與α螺旋結(jié)構(gòu)有共同之處tRNA三葉草結(jié)構(gòu)：反密碼環(huán)和氨基酸側(cè)臂rRNA葉狀結(jié)構(gòu)·三級(jí)結(jié)構(gòu)全部的空間構(gòu)象改變次級(jí)鍵：氫鍵、疏水作用、鹽鍵、范德華力代表：肌紅蛋白超三級(jí)結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)域染色體形成tRNAL型結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)亞基+亞基次級(jí)鍵，以疏水作用為主代表：血紅蛋白理化性質(zhì)兩性解離、呈色效應(yīng)、紫外吸收、膠體性質(zhì)（蛋白質(zhì)）變性和復(fù)性、呈色效應(yīng)、紫外吸收分離和檢測(cè)分離和純化、westernbloting、等電聚焦、雙向電泳分離和純化、northernbloting、PCR蛋白質(zhì)核酸DNARNA元素組成C、H、O、N和SC、H、O、第10章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)第10章DNA的生物合成復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈D本章主要內(nèi)容：

復(fù)制的基本規(guī)律

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

DNA損傷（突變）與修復(fù)本章主要內(nèi)容：復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativ一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開(kāi)為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念:一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征DNA生物合成時(shí)，母鏈AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子代DNAATCGATTAATAT+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子密度梯度實(shí)驗(yàn):——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果密度梯度實(shí)驗(yàn):——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-D子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:全保留式按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸形成雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖像原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)

。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’三、DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)三、DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制3順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(laggingstrand)

。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationDNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymol參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫(xiě)為DNA-pol；模板(template):

解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):dAT一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(d聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3方向進(jìn)行。聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需引物和模板；二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性:5′AGCTTCAG（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠ原核生物的DNA聚合酶原核生物的DNA聚合酶功能：DNA-polⅠ（109kD）對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。功能：DNA-polⅠ（109kD）對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延（二）常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol（二）常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種DNA-pol起始真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來(lái)保證復(fù)制的保真性。三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)（一）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來(lái)的酶，外切酶是有方向性的。（一）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正核酸外A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNApolⅠ的校讀功能A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻（二）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

（二）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)E.Coli基因圖E.Coli基因圖解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵108局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈復(fù)制過(guò)程正超螺旋的形成：108局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)拓?fù)涿傅淖饔梅绞剑和負(fù)涿傅淖饔梅绞剑何?、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式：五、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3-HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶的作用：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。功能：提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長(zhǎng)中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓?fù)涿盖袛唷⒄砗蟮膬涉湼淖兺負(fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較

提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長(zhǎng)中的DNA生物合成過(guò)程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開(kāi)成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.DNA解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。DnaADnaB、DnaCDNA3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件（二）復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

（二）復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTP領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。隨從鏈的合成隨從鏈的合成同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長(zhǎng)同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長(zhǎng)階段一階段二階段三階段四階段一階段二階段三階段四復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復(fù)制的終止過(guò)程：切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP5第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DN真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。

復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物－模板鏈；并且PCNA使polδ獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuc細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclindependentkinase，CDK)。

細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及GCDK相匹配的周期蛋白作用點(diǎn)CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1→S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2→M期哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和CDKCDK相匹配的周期蛋白作用點(diǎn)CDK2CyclinD1,D哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使細(xì)胞周期開(kāi)放/關(guān)閉，因此被形容為細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)(checkpoint)蛋白。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(aDNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-polδ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。（二）真核生物復(fù)制的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換DNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體真核生物復(fù)制叉的延長(zhǎng)：3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。（三）端粒酶參與解決染色53355335+533335553355335+5333355第章DNA的生物合成（X頁(yè)）課件切除引物的兩種機(jī)制切除引物的兩種機(jī)制線性DNA復(fù)制的末端線性DNA復(fù)制的末端端粒(telomere)

指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成：端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humant端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式第四節(jié)雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。少數(shù)低等生物如M13噬菌體，它的感染型只含單鏈DNA。原核生物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進(jìn)行復(fù)制。雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RRNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立繁殖。在某些情況下，前病毒基因組通過(guò)基因重組(recombination)，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達(dá)。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨(dú)立繁殖或整合，都可成為致病的原因。RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)三、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制和線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplicati3-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5dNTPDNA-polγD環(huán)復(fù)制(D-looprep