2022/12/13第十二章

色譜分析基礎(chǔ)

一、色譜法概述

generalizationof

chromatographanalysis

二、色譜法的分類classificationofchromatograph三、氣相色譜分離過(guò)程separationprocessofgaschromatograph

fundamentalofchromatographanalysis

2022/12/132022/12/13一、概述色譜法是一種分離技術(shù)。

混合物最有效的分離、分析方法。

俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年分離植物葉的色素使用的裝置。色譜原型裝置，如圖。玻璃管碳酸鈣石油醚2022/12/13色譜法(chromatography)

流動(dòng)相攜帶樣品流過(guò)固定相,試樣組分在固定相和流動(dòng)相間的吸附、溶解、分配、離子交換或其他親和作用的能力不同,樣品分離------色譜法2022/12/13特點(diǎn)

靈敏快速高效2022/12/13二、色譜法分類

（classification

of

chromatograph）氣相色譜法（gaschromatography）

液相色譜法（liquidchromatography）１、按兩相所處的狀態(tài)分類

氣固色譜法液固色譜法

氣液色譜法液液色譜法2022/12/13氣相色譜的結(jié)構(gòu)流程圖2022/12/13２、按操作形式不同分類

1.柱色譜法2.薄層色譜法3.紙色譜法2022/12/132.薄層色譜法

(thin-layerchromatography,TLC)

固定相涂布在平板上形成薄層，把試樣點(diǎn)在薄板上，然后用溶劑展開(kāi)，根據(jù)薄板上斑點(diǎn)位置及大小進(jìn)行定性和定量分析。2022/12/133、按分離原理分類按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的不同，又可將其分為：1.吸附色譜法2.分配色譜法3.離子交換色譜法4.尺寸排阻色譜法5.親和色譜法2022/12/131.吸附色譜法

(adsorptionchromatography)

利用吸附劑對(duì)不同組分吸附能力的不同2022/12/132.分配色譜法

(partitionchromatography)

利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同2022/12/133.離子交換色譜法

（ion-exchangechromatography

利用組分在離子交換劑（固定相）上的離子交換力大小不同2022/12/134.尺寸排阻色譜法

(sizeexchangechromatography）

利用分子大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透2022/12/13三、色譜分離過(guò)程

separationprocessofgaschromatograph1、色譜分離過(guò)程

該過(guò)程主要利用試樣中各組分在固定相和流動(dòng)相間具有不同的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的能力差異從而按先后不同的次序從固定相中流出2022/12/13色譜流出曲線

混合組分的分離過(guò)程及檢測(cè)器對(duì)各組份在不同階段的響應(yīng)2022/12/132、色譜流出曲線與術(shù)語(yǔ)1.基線

無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。2.保留值

（1）時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間；

調(diào)整保留時(shí)間（tR

＇）：tR＇=tR－tM

2022/12/13（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR－VM

2022/12/134.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來(lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=42022/12/13

色譜流出曲線的意義：

色譜保留值——定性依據(jù)色譜峰高或面積——定量依據(jù)色譜峰數(shù)——樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)色譜保留值或區(qū)域?qū)挾?/p>

——色譜柱分離效能評(píng)價(jià)指標(biāo)色譜峰間距

——固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的依據(jù)2022/12/13苯系物標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜圖

1－苯；2－甲苯；3—乙苯；4－對(duì)二甲苯；5－間二甲苯；

6－鄰二甲苯；7－異丙苯；8－苯乙烯

2022/12/132.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過(guò)程叫做分配過(guò)程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。2022/12/13分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。2022/12/133.分配比（partionradio）k

在實(shí)際工作中，也常用分配比來(lái)表征色譜分配平衡過(guò)程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。3.分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2022/12/134.容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系

容量因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積，對(duì)不同類型色譜柱，VS的含義不同；

氣-液色譜柱：VS為固定液體積；

氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；2022/12/135.分配比與保留時(shí)間的關(guān)系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：若組分和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的分離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)2022/12/13

氣相色譜分析法一、氣相色譜儀gaschromatographicinstruments二、氣相色譜儀流程processofgaschromatograph三、氣相色譜主要部件mainassemblyofgaschromatograph第一節(jié)

氣相色譜儀gaschromatographicanalysis,GCgaschromatographicinstruments2022/12/13一、氣相色譜儀器

gaschromatographicinstruments2022/12/13氣相色譜儀器2022/12/13氣相色譜儀器2022/12/13二、氣相色譜結(jié)構(gòu)流程

processofgaschromatograph1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)溫控系統(tǒng)2022/12/13結(jié)構(gòu)流程2022/12/13二、氣相色譜結(jié)構(gòu)流程

processofgaschromatograph1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)溫控系統(tǒng)2022/12/13三、氣相色譜儀主要部件

mainassemblyofgaschromatograph1.載氣系統(tǒng)包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮?dú)狻⒑?；凈化干燥管：去除載氣中的水、有機(jī)物等雜質(zhì)（依次通過(guò)分子篩、活性炭等）；載氣流速控制：壓力表、流量計(jì)、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。2022/12/132.進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣器+氣化室；氣體進(jìn)樣器（六通閥）：推拉式和旋轉(zhuǎn)式兩種。試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱；2022/12/13液體進(jìn)樣器：不同規(guī)格的專用注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細(xì)管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器，清洗、潤(rùn)沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過(guò)程自動(dòng)完成，一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。

氣化室：將液體試樣瞬間氣化的裝置。無(wú)催化作用。2022/12/133.色譜柱（分離柱）色譜柱：色譜儀的核心部件。柱材質(zhì)：不銹鋼管或玻璃管，內(nèi)徑3-6毫米。長(zhǎng)度可根據(jù)需要確定。柱填料：粒度為60-80或80-100目的色譜固定相。

液-固色譜：固體吸附劑液-液色譜：擔(dān)體+固定液柱制備對(duì)柱效有較大影響，填料裝填太緊，柱前壓力大，流速慢或?qū)⒅滤溃粗障扼w積大，柱效低。有關(guān)固定液性質(zhì)及其選擇見(jiàn)下一節(jié)。2022/12/134.檢測(cè)系統(tǒng)

色譜儀的眼睛，通常由檢測(cè)元件、放大器、顯示記錄三部分組成；被色譜柱分離后的組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，按其濃度或質(zhì)量隨時(shí)間的變化，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)電信號(hào)，經(jīng)放大后記錄和顯示，給出色譜圖；

檢測(cè)器：廣普型——對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)；

專屬型——對(duì)特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng)；常用的檢測(cè)器：熱導(dǎo)檢測(cè)器、氫火焰離子化檢測(cè)器；有關(guān)檢測(cè)器原理、結(jié)構(gòu)見(jiàn)第三節(jié)。2022/12/135.溫度控制系統(tǒng)

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)；氣化室、分離室、檢測(cè)器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫度；氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；檢測(cè)器：保證被分離后的組分通過(guò)時(shí)不在此冷凝；

分離室：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。當(dāng)試樣復(fù)雜時(shí)，分離室溫度需要按一定程序控制溫度變化，各組分在最佳溫度下分離；2022/12/13一、高效液相色譜法的特點(diǎn)二、流程及主要部件三、影響分離的因素四、高效液相色譜法的主要分離類型

高效液相色譜法2022/12/13液相色譜儀（1）2022/12/13液相色譜儀（2）2022/12/13液相色譜儀（3）2022/12/13液相色譜儀（4）2022/12/13一、高效液相色譜法的特點(diǎn)

特點(diǎn)：高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2022/12/13二、流程及主要部件1.流程2022/12/132.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2022/12/13(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/12/13(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/13(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/12/13(5)高效液相色譜檢測(cè)器紫外光度檢測(cè)器（UV）：最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測(cè)器。2022/12/13光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/13四、高效液相色譜法的主要分離類型1.吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。2022/12/133.離子交換色譜固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；2022/12/13一、毛細(xì)管色譜的特點(diǎn)二、結(jié)構(gòu)流程及操作條件的優(yōu)化三、分流比調(diào)節(jié)

毛細(xì)管色譜法2022/12/13一、毛細(xì)管色譜的特點(diǎn)1.毛細(xì)管色譜分離能力提高的途徑(1)由塔板理論：增加柱長(zhǎng)減小柱徑，即增加柱子塔板數(shù)；(2)由速率理論：減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力，也即降低塔板高度。2022/12/132.毛細(xì)管色譜柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1）不裝填料阻力小，長(zhǎng)度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱，管徑0.2mm。（2）氣流單途徑通過(guò)柱子，消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散。（3）固定液直接涂在管壁上，總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄，則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。（4）毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米3000～4000塊理論塔板，一支長(zhǎng)度100米的毛細(xì)管柱，總的理論塔板數(shù)可達(dá)104～106。

2022/12/133.毛細(xì)管色譜具有的優(yōu)點(diǎn)（1）分離效率高：比填充柱高10～100倍；（2）分析速度快：用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度（3）色譜峰窄、峰形對(duì)稱。較多采用程序升溫方式；（4）靈敏度高，一般采用氫焰檢測(cè)器。（5）渦流擴(kuò)散為零。2022/12/134.毛細(xì)管色譜的種類與制備方法毛細(xì)管柱按其制備方法可分為以下幾種：涂壁開(kāi)管柱（wallcoatedopentubular，WCOT柱）：將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對(duì)簡(jiǎn)單，但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。多孔層開(kāi)管柱（porouslayeropentubular，PLOT柱）：在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒。構(gòu)成毛細(xì)管氣固色譜。載體涂漬開(kāi)管柱（supportcoatedopentubular，SCOT柱）：將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較WCOT柱高?；瘜W(xué)鍵合或交聯(lián)柱：將固定液通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。2022/12/13二、結(jié)構(gòu)流程具有分流和尾吹裝置2022/12/13三、分流比調(diào)節(jié)毛細(xì)管柱內(nèi)徑很細(xì)，因而帶來(lái)三個(gè)問(wèn)題：（1）允許通過(guò)的載氣流量很小。（2）柱容量很小，允許的進(jìn)樣量小。