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基因工程的利與弊基因工程的利與弊(完整資料）(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）王麗君32130０3964基因工程是一項(xiàng)很精密的尖端生物技術(shù)?？梢园涯骋簧锏幕蜣D(zhuǎn)殖送入另一種細(xì)胞中，甚至可把細(xì)菌、動植物的基因互換。當(dāng)某一基因進(jìn)入另一種細(xì)胞，就會改變這個細(xì)胞的某種功能?；蚬こ虒τ谌祟惖睦滓恢笔莻€爭議的問題,主要是這項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)造出原本自然界不存在的重組基因.但它為醫(yī)藥界帶來新希望,在農(nóng)業(yè)上提高產(chǎn)量改良作物，也可對環(huán)境污染、能源危機(jī)提供解決之道，甚至可用在犯罪案件的偵查.但它亦引起很大的憂慮與關(guān)切.當(dāng)此科技由嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至大規(guī)模醫(yī)藥應(yīng)用或商業(yè)生產(chǎn)時,我們?nèi)绾卧u估它的安全性？此項(xiàng)技術(shù)是否可能因?yàn)槿藶槭Э?反而危害人類健康并破壞大自然生態(tài)平衡?觀點(diǎn)：辨證的看待基因工程的利與弊一.基因工程可用來篩檢遺傳疾病乃是由于父或母帶有錯誤的基因。基因篩檢法可以快速診斷基因密碼的錯誤；基因治療法則是用基因工程技術(shù)來治療這類疾病。產(chǎn)前基因篩檢可以診斷胎兒是否帶有遺傳疾病,這種篩檢法甚至可以診斷試管內(nèi)受精的胚胎，早至只有兩天大,尚在八個細(xì)胞階段的試管胚胎。二?；蛑委煼壳搬t(yī)學(xué)界正在臨床試驗(yàn)多種遺傳病的基因治療法。最早采用基因治療的是一種先天免疫缺乏癥,又稱氣泡男孩癥,患病嬰幼童因?yàn)橄倜摪坊蛴腥毕?，骨髓不能制造正常白血球發(fā)揮免疫功能，必須生活在與外界完全隔離的空氣罩內(nèi).最新的治療法是由病人骨髓分離出白血球的干細(xì)胞，把正常的酵素基因接在經(jīng)過改造不具毒性的反錄病毒，藉此病毒送入白血球干細(xì)胞，再將干細(xì)胞送回病人體內(nèi),則病人可產(chǎn)生健康的白血球獲得免疫功能。這項(xiàng)臨床試驗(yàn),在美國的女病童證明很成功.三.對農(nóng)業(yè)界的貢獻(xiàn)基因轉(zhuǎn)殖的細(xì)菌用處也很大,如改造細(xì)菌可以消化垃圾廢紙,而這些細(xì)菌又可成為一種蛋白質(zhì)的營養(yǎng)來源?；蜣D(zhuǎn)殖的細(xì)菌可帶有人類基因，以生產(chǎn)醫(yī)療用的胰島素及生長激素等。其實(shí)基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，在某些方面而言并不稀奇.自古以來,人們即努力而有計劃地進(jìn)行育種,譬如一個新種小麥,乃是經(jīng)過上千代重復(fù)雜交育成的.目前的小麥含有許多源自野生黑麥的基因。農(nóng)人早在基因工程技術(shù)發(fā)明以前，就知道將基因由一種生物轉(zhuǎn)移至另一生物。傳統(tǒng)的育種也可大量提高產(chǎn)量。但是傳統(tǒng)的育種過程緩慢,結(jié)果常常難以預(yù)料.基因工程可選擇特定基因送入生物體內(nèi),大大提高育種效率，更可把基因送入分類上相差很遠(yuǎn)的生物，這是傳統(tǒng)的育種做不到的。不久,在美國即將有基因工程培育出來的西紅柿要上市了.這種西紅柿含有反意基因（anｔisｅｎsegeｎe)，能使西紅柿成熟時不會變軟易爛。基因工程的弊端：一.農(nóng)林漁牧的應(yīng)用-—生態(tài)環(huán)保的顧慮目前全世界正重視發(fā)展永續(xù)性農(nóng)業(yè),希望農(nóng)業(yè)除了具有經(jīng)濟(jì)效益,還要生生不息，不破壞生態(tài)環(huán)境?；蚬こ陶蓭兔鉀Q這類問題。基因工程可以改良農(nóng)糧作物的營養(yǎng)成分或增強(qiáng)抗病抗蟲特性?？梢栽黾有笄蓊惖纳L速率、牛羊的泌乳量、改良肉質(zhì)及脂肪含量等。二.基因轉(zhuǎn)殖動物——愛護(hù)動物人士的關(guān)切基因轉(zhuǎn)殖動物對于生物醫(yī)學(xué)研究，真是一大恩賜?？茖W(xué)家現(xiàn)在可將基因送入實(shí)驗(yàn)室的老鼠，以研究基因的表達(dá)調(diào)控功能.也可以把實(shí)驗(yàn)動物的某個基因刻意破壞，培育出患有類似人類遺傳疾病的動物,以利治療方法的探討。美國一家公司已經(jīng)培育出一種基因轉(zhuǎn)殖老鼠，它在數(shù)個月大時會長出癌瘤,此項(xiàng)發(fā)明正在申請專利.但是愛護(hù)動物人士已表示嚴(yán)重關(guān)切，他們認(rèn)為應(yīng)該限制基因工程技術(shù)如此折磨虐待實(shí)驗(yàn)動物。不久的將來，基因工程技術(shù)仍只限于轉(zhuǎn)殖少數(shù)的基因，如此培育出來的生物仍將是我們熟悉的生物。但是有很多疾病及生物特征是由多數(shù)基因決定的，而且基因常常不是獨(dú)立行使功能,它們會受環(huán)境的影響。譬如一組基因會造成某人罹患?xì)獯?，但癥狀受生活的環(huán)境影響很大。一個人罹患糖尿病的機(jī)率,也與環(huán)境因子（飲食條件)息息相關(guān)。一個天才鋼琴家的音樂天賦包括聽力及靈敏的雙手巧妙地配合，這跟他的遺傳基因、童年音樂的啟發(fā)、生活環(huán)境等都有關(guān)連.所以我們在還未了解基因與環(huán)境因子的互動關(guān)系前，還不能奢望創(chuàng)造出具有超高智商的人,或是利用基因篩檢法篩選出具有特殊天賦的孩子。２1世紀(jì)是基因工程技術(shù)蓬勃發(fā)展的時代，基因工程的興起是生物革命的必然結(jié)果,盡管基因工程的隱憂及爭論眾說紛紜,但其給人帶來的好處是顯而易見的。希望隨著生物界的不斷發(fā)展,使基因工程的安全性得到保證，讓人們在生活的各個方面都能感受基因工程給人類帶來的利益。不久的將來,基因工程技術(shù)仍只限于轉(zhuǎn)殖少數(shù)的基因，如此培育出來的生物仍將是我們熟悉的生物.但是有很多疾病及生物特征是由多數(shù)基因決定的，而且基因常常不是獨(dú)立行使功能,它們會受環(huán)境的影響.譬如一組基因會造成某人罹患?xì)獯?，但癥狀受生活的環(huán)境影響很大。一個人罹患糖尿病的機(jī)率，也與環(huán)境因子(飲食條件）息息相關(guān)。在這個時代，基因工程的興起是生物革命的必然結(jié)果,盡管基因工程的隱憂及爭論眾說紛紜，但其給人帶來的好處是顯而易見的.希望隨著生物界的不斷發(fā)展,使基因工程的安全性得到保證,讓人們在生活的各個方面都能感受基因工程給人類帶來的利益?；蚬こ淘韮?nèi)容提要基因工程又稱基因操作、重組DNＡ技術(shù)，是P.Ｂerg等于１9７2年創(chuàng)建的?；蚬こ碳夹g(shù)涉及的基本過程包括“切、連、轉(zhuǎn)、選”.該技術(shù)有兩個基本的特點(diǎn)∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá).基因工程中使用多種工具酶,包括限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其他一些參與DNA合成與修飾的酶類。限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,屬于水解酶類。根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點(diǎn)，被分為三大類.Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最常用的酶，該類酶的分子量小,專一性強(qiáng),切割的方式有平切和交錯切，作用時需要Mg＋＋作輔助因子,但不需要ATP和SAM。第一個被分離的Ⅱ類酶是HｉndⅡ。連接酶是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸酶,有DNA連接酶和RＮA連接酶之分?；蚬こ讨惺褂玫倪B接酶來自于原核生物,有兩種類型的ＤNA連接酶∶E．coｌiDNＡ連接酶和Ｔ4－ＤNA連接酶?；蚬こ讨惺褂玫闹饕荰4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染的E．cｏli中分離的一種單鏈多肽酶，既能進(jìn)行粘性末端連接又能進(jìn)行平末端連接。載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子，有三種主要類型∶質(zhì)粒ＤNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒，在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。DＮA重組連接的方法大致分為四種：粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法.粘性末端連接法是最常用的DNA連接方法，是指具有相同粘性末端的兩個雙鏈ＤNA分子在DNＡ連接酶的作用下,連接成為一個雜合雙鏈DNA。平末端連接是指在T４DNA連接酶的作用下,將兩個具有平末端的雙鏈ＤNA分子連接成雜種DNA分子。同聚物加尾連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端，外源DＮA和載體DＮA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）,然后在ＤNA連接酶的作用下，連接成為重組的DＮA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段，但方法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。將人工合成的或來源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切酶的識別序列)，加到載體或外源ＤNA的分子上，然后通過酶切制造黏性末端的方法稱為接頭連接法?；蛭膸旆譃榛蚪M文庫、cDNA文庫等,是指在一種載體群體中,隨機(jī)地收集著某一生物DNA的各種克隆片段，理想地包含著該物種的全部遺傳信息。DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組ＤＮA分子的轉(zhuǎn)化。目前常用的誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法是ＣａCl２法(圖３－20），此外也可以用基因槍等方法轉(zhuǎn)化外源ＤＮA。重組體篩選有遺傳學(xué)方法、核酸雜交篩選法等.基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，目前在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療中已經(jīng)顯示了巨大的應(yīng)用前景,并形成了一大批生物技術(shù)產(chǎn)業(yè).基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因（DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖,在體外構(gòu)建雜種ＤＮA分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品;或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，揭示生命活動規(guī)律?；蚬こ碳夹g(shù)誕生于２0世紀(jì)７０年代初，它是一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)，它的創(chuàng)立和發(fā)展使生命科學(xué)產(chǎn)生了一次重大飛躍,證明并實(shí)現(xiàn)了基因的可操作性，使人類從簡單地利用天然生物資源走向定向改造和創(chuàng)造具有新品質(zhì)的生物資源的時代.基因工程技術(shù)誕生至今已經(jīng)取得了輝煌的成就，成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最有生命力和最引人注目的前沿學(xué)科之一,基因工程也是當(dāng)今新的產(chǎn)業(yè)革命的一個重要組成部分。第一節(jié)基因工程技術(shù)的誕生基因工程又稱基因操作（geｎemａniｐｕlatｉｏn），重組DＮA（rｅcomｂinａntDNＡ）技術(shù)，是70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個分支學(xué)科。一、基因工程技術(shù)的誕生1972年，P.。Berg等在PＮAS上發(fā)表了題為∶“將新的遺傳信息插入SV40病毒DNA的生物化學(xué)方法:含有λ噬菌體基因和E.cｏli半乳糖操縱子的環(huán)狀SV４0DＮＡ”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。ＳV40病毒是猿猴病毒,是一種直徑為４50的球形病毒,分子量為２8×１06道爾頓。ＳV40的DNA是環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，全長５24３個堿基對，編碼三個衣殼蛋白VＰ1、VP2、VP3和一個T抗原。SＶ40DNA上有一個限制性內(nèi)切酶Ｅ.cｏRⅠ的切點(diǎn).Berｇ等首先用化學(xué)方法構(gòu)建了一個二聚體的環(huán)狀SV40DNA（圖３—１）。圖３—1重組的SV４0二聚體的構(gòu)建（引自Berget.aｌ，1972）當(dāng)時所用的連接方法是同聚物譜尾法，重組體的鑒定主要是通過電子顯微鏡比較分子量大小.當(dāng)獲得二聚體SV40DNA后,Ｂerｇ等就證明了環(huán)狀DNＡ被內(nèi)切酶切成線性DNA后能夠重新環(huán)化，并且能夠同另外的分子重組。于是他們進(jìn)行第二步的實(shí)驗(yàn)就是從λｄvgalDＮＡ中制備含有E．coli的半乳糖操縱子DNＡ，用上述同樣的方法進(jìn)行重組連接，并獲得成功.Bｅｒg等的工作是人類第一次在體外給遺傳物質(zhì)動手術(shù)，標(biāo)志著一個新時代的到來,為此他獲得了１98０年諾貝爾化學(xué)獎.二、基因操作的基本過程和特點(diǎn)基因工程的操作可用圖3-2表示∶圖３-２基因工程的基本過程（引自O(shè)ｌd＆Primrｏse,1９80）它所涉及的過程可用“分（合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒”六個字表示。分(合成)∶指DNA的制備，包括從生物體中分離或人工合成。分離制備或合成制備DNA的方法都有很多種。切∶即在體外將DＮA進(jìn)行切割,使之片段化或線性化。連∶即在體外將不同來源的ＤNA分子重新連接起來,構(gòu)建重組ＤNA分子.轉(zhuǎn)∶即將重組連接的DＮA分子通過一定的方法重新送入或細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá).選∶從轉(zhuǎn)化的全群體中將所需要的目的克隆挑選出來；鑒∶就是進(jìn)行對篩選出來的重組體進(jìn)行鑒定,因?yàn)橛行┲亟M體并非是所需要的,必需通過分析鑒定.基因工程有兩個基本的特點(diǎn)∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá)。遺傳重組是生物進(jìn)化的推動力，自然界中發(fā)生的遺傳重組主要是靠有性生殖?；蚬こ碳夹g(shù)的誕生使人們能夠在試管里進(jìn)行分子水平上的操作,構(gòu)建在生物體內(nèi)難以進(jìn)行的重組,然后將重組的遺傳物質(zhì)引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞,讓其在宿主細(xì)胞中進(jìn)行工作。這實(shí)際上是進(jìn)行無性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有稱為基因克隆。第二節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶外科醫(yī)生給患者動手術(shù)需要手術(shù)刀，基因工程師們給ＤＮA分子(基因)動手術(shù)需要分子手術(shù)刀，這就是工具酶?；蚬こ讨惺褂玫墓ぞ呙负芏?包括限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其他一些參與DＮA合成與修飾的酶類，最重要的是限制性內(nèi)切核酸酶?；蚬こ躺习涯切┚哂凶R別雙鏈DＮA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。一、限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)1９5２年Luria、Human在T偶數(shù)噬菌體、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在λ噬菌體對大腸桿菌的感染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)象。正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究,導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。噬菌體在某一特定細(xì)菌宿主中生長的能力,取決于它最終在其中繁殖的細(xì)菌是什么菌株。例如,將A噬菌體從一株大腸桿菌轉(zhuǎn)移到另外一株，其生長效率往往會削弱，對這兩個菌株的滴定度可差好幾個數(shù)量級。第二個菌株釋放的噬菌體能百分之百再感染同類菌株，但是若先將它們感染原來的宿主菌,再將釋放的子代噬菌體重新感染第二個菌株時,感染率要大大下降。此種現(xiàn)象即為宿主控制的限制作用（host-Contrｏllｅdｒestrictioｎ）。用放射性同位素標(biāo)記的噬菌體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在受感染的宿主細(xì)胞中,噬菌體生長的限制伴有噬菌體DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌體的感染宿主菌株并不導(dǎo)致類似的噬菌體DNＡ的降解.如果某一細(xì)菌細(xì)胞具有一種能選擇性降解來自侵染病毒（或其他來源)的核酸酶，那么，它必須能將這種外來DNA同它自己的DNA區(qū)分開來,之所以能夠如此，乃是通過稍為宿主控制的修飾作用（ｈoｓｔ—cｏnｔrolｌedmoｄificatiｏｎ）。因此，限制（resｔrictiｏn)作用是指細(xì)菌的限制性核酸酶對DNＡ的分解作用，限制一般是指對外源DNA侵入的限制.修飾(modiｆiｃatｉon）作用是指細(xì)菌的修飾酶對于DNA堿基結(jié)構(gòu)改變的作用（如甲基化),經(jīng)修飾酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。到20世紀(jì)60年代中期，科學(xué)家推測細(xì)菌中有限制－修飾系統(tǒng)(restｒictioｎ—ｍｏdifｉｃatioｎsystｅm。Ｒ—Msyｓｔem)。該系統(tǒng)中有作用于同一DＮA的兩種酶，即分解DNA的限制酶和改變DＮA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶，而且，這兩種酶作用于同一DNA的相同部位。一般說來，不同種的細(xì)菌或不同種的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制—修飾系統(tǒng)。1968年，Meseｌｓon從E．colｉＫ株中分離出了第一個限制酶EcoK，同年Ｌｉnn和Aeber從E。cｏliB株中分離到限制酶ＥcｏB.遺憾的是，由于EcoK和ＥcoB這兩種酶的識別和切割位點(diǎn)不夠?qū)Ｒ?在基因工程中意義不大。１970年,Sｍitｈ和Wiｌcｏｘ從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶，能夠特異性地切割DNＡ，這個酶后來命名為HｉnｄⅡ，這是第一個分離到的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶.由于這類酶的識別序列和切割位點(diǎn)特異性很強(qiáng)，對于分離特定的DＮＡ片段就具有特別的意義.二、限制性內(nèi)切核酸酶的命名和分類（一)限制性內(nèi)切核酸酶的命名按照國際命名法,限制性內(nèi)切核酸酶屬于水解酶類。由于限制性酶的數(shù)量眾多,而且越來越多,并且在同一種菌中發(fā)現(xiàn)幾種酶。為了避免混淆，1973年Ｓmｉtｈ和Nａt(yī)haｎs對內(nèi)切酶的命名提出建議,1９８0年，Ｒobｅｒｔs對限制性酶的命名進(jìn)行分類和系統(tǒng)化。限制性酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的個一個首字母，再加上序號,將限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點(diǎn)列于表3-１。表3—1限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點(diǎn)條目要點(diǎn)基本原則３—4個字母組成,方式是：屬名+種名+株名+序號首字母取屬名的第一個字母，且大寫第二字母取種名的第一個字母，小寫第三字母①取種名的第二個字母,小寫;②若種名有詞頭,且已命名過內(nèi)切酶，則取詞頭后的第一字母代替第四字母若有株名,株名則作為第四字母,是否大小寫,根據(jù)原來的情況而定順序號若在同一菌株中分離了幾個限制性內(nèi)切核酸酶，則按先后順序冠以Ｉ、ＩＩ、IＩI,....。等如：EcｏＫ：Ｅsｃherichiacoli

Ｋ（大腸桿菌K株）（二)限制性內(nèi)切核酸酶的分類限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點(diǎn)，將它們分為三大類。１.I類限制性內(nèi)切核酸酶I類限制性內(nèi)切核酸酶的分子量較大，一般在３0萬道爾頓以上，通常由三個不同的亞基所組成。例如限制性酶EcoB是由R（135kD),M(6２ｋD）和S（55ｋD)三種亞基組成的復(fù)合酶,這三個亞基分別由不同的基因編碼。全酶的總分子量為4４9ｋＤ,共5個亞基，其中Ｒ亞基和M亞基各兩分子。Ⅰ類酶不僅是一種核酸內(nèi)切酶,同時在酶分子上還具有甲基化酶和ATPａse的活性，所以是具有多種酶活性的復(fù)合酶類.作用時除了需要Mg++作輔助因子外，還要求ATP和Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳAＭ）的存在。Ⅰ類酶具有特異的識別序列，大約１5個堿基對。Ⅰ類酶雖然能夠在一定序列上識別ＤＮA分子，并能同DＮA分子作用，因其識別DＮA后,要朝一個方向或兩個方向移動一段距離(通常為10０0個堿基左右），并且要形成一個環(huán)才能切割DNA(圖３—3)，所以識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致,產(chǎn)生的片段較大.圖3－３I類酶的作用方式（引自Lｅwin，1９97)２．Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亞基組成類似于Ⅰ類酶,作用方式基本同Ⅱ類酶。如EcoＰ1是由兩個亞基組成，一個亞基（Ｍ亞基）負(fù)責(zé)位點(diǎn)識別和修飾。另一個亞基(Ｒ亞基)具有核酸酶的活性(圖３—5)。切割DＮA時需要ATＰ,Mg2+,也能被ＳAM激活,但并非必需。圖3-４Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶（引自Ｌewin,1997)3。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶這類酶的分子量較小.一般在2—４萬道爾頓，通常由2—４個相同的亞基所組成。它們的作用底物為雙鏈DNA,極少數(shù)Ⅱ類酶也可作用于單鏈DNＡ,或DNA/RNA雜種雙鏈。這類酶的專一性強(qiáng),它不僅對酶切點(diǎn)鄰近的兩個堿基有嚴(yán)格要求，而且對更遠(yuǎn)的堿基也有要求，因此,Ⅱ類酶既具有切割位點(diǎn)的專一性，也具有識別位點(diǎn)的專一性，一般在識別序列內(nèi)切割.切割的方式有平切和交錯切，產(chǎn)生平末端的ＤＮＡ片段或具有突出粘性末端的DNＡ片段（５'或３’粘性末端).作用時需要Mg+＋作輔助因子，但不需要AＴＰ和SAM.Ⅱ類酶與對應(yīng)的甲基化酶在蛋白亞基上尚未發(fā)現(xiàn)有什么關(guān)系，第一個被分離的Ⅱ類酶是HiｎdⅡ。三。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的性質(zhì)1。識別序列的特異性在３類限制性內(nèi)切核酸酶中，Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的特異性最強(qiáng)。大多數(shù)Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識別的序列是回文序列。如ＢamHＩ和BglI都是識別六個堿基的ＤNA序列(圖3—5）,都是完全的回文序列。這段序列有兩個基本的特征,第一是能夠中在間劃一個對稱軸,兩側(cè)的序列兩兩對稱互補(bǔ)配對，第二個特點(diǎn)是兩條互補(bǔ)鏈的5'到3'的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180０，則兩條鏈重疊。圖３—5Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識別的回文序列(引自D．Ｖoet＆VoｔｅJ．G.1995)2．限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率與速度切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA分子中預(yù)測的切點(diǎn)數(shù)。由于ＤNA是由四種類型的單核苷酸組成，假定DＮA的堿基組成是均以的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的,那么對于任何一種限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率,理論上應(yīng)為１/４ｎ，n表示該限制性內(nèi)切核酸酶識別的堿基數(shù)。如識別4個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每256個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)（１/44=1/2５６)，識別5個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1０24個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)，余下類推。實(shí)際上因DＮA的分布是不均一的,且有大量的重復(fù)序列,加上內(nèi)切酶的切點(diǎn)具有GC傾向，所以實(shí)際的頻率偏低.如同是識別6個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，切割的頻率相差很大∶EcoRI4０00；BaｍＨI：6０00；SalI:8０00;HpａＩI:200.根據(jù)限制性內(nèi)切酶切割DNA所產(chǎn)生的產(chǎn)物末端,發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶對DNA的切割有兩種方式,即平切和交錯切。所謂平切，就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNＡ分子,這樣產(chǎn)生的末端就是平末端.交錯切就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的不同位置切割DNＡ，產(chǎn)生的ＤNA片段的末端不是平齊的(圖３—６）。圖3-６平末端與黏性末端（Ｈarｔl,1991）Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的切割產(chǎn)物有平末端和粘性末端(ｃohesiveend)。粘性末端是指DＮＡ分子的兩端具有彼此互補(bǔ)的一段突出的單鏈部分,這一小段單鏈部分和同一分子的另一端或其它分子末端的單鏈部分如果互補(bǔ)的話，則能通過互補(bǔ)堿基之間的配對，形成雙鏈.并在DNA連接酶的作用下,使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀,或使兩個分子連成一大的線狀分子.不同限制性內(nèi)切酶切割DNＡ產(chǎn)生的三種不同類型的末端（表3－３）.表3-3某些限制性內(nèi)切酶及產(chǎn)生的末端５'-粘性末端3’粘性末端平末端酶識別序列酶識別序列酶識別序列TaqＩT/CＧAＰｓtICTGCA／GＡluIＡG/CTＣlａIAT/CGATSacIGＡGCT/CFnuDⅡCG/CＧMboI／ＧATＣSpｈIGＣATG/CＤpnIＧＡ／TＣBglⅡA/GＡTCＴBｄeIＧＧCGC/CＨaeⅢGG/CCBaｍHＩG/GAＴCＣApaＩＧGGCC/CPvuⅡCAG/CＴGBclIT/GATCAKpnIGＧTＡC/CＳmaＩCCC/GＧＣＨindⅢＡ／AGCＴT

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ＥcoRⅤＧAT/ＡＴC基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，除了需要限制性內(nèi)切酶外,還需要其他一些工具酶包括連接酶、ＤＮＡ聚合酶、ＲNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DＮA或RＮA進(jìn)行各種各樣的修飾。其中最重要的是連接酶。第三節(jié)基因工程載體載體（vectｏr,ｖehiｃｌe)的本意就是媒介體,基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DＮA分子,稱為克隆載體?；蚬こ讨杏腥N主要類型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DＮＡ、科斯質(zhì)粒，其中質(zhì)粒DNＡ是最常用的載體,但運(yùn)載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體ＤNA的結(jié)合體，運(yùn)載能力最高（圖３—7）.在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的,出現(xiàn)了各種類型的改造載體.圖３-７三種類型的載體（引自Ｇｒeenｅ，１9９８）一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasｍiｄ）是染色體以外的遺傳物質(zhì)，它是雙鏈閉合環(huán)狀ＤＮA分子，其大小可從１kb到200kb左右，能夠在宿主內(nèi)利用宿主的酶系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒是基因工程的主要載體。（一）質(zhì)粒概念１９46—194７年間，Lederｂerｇ和Ｔatuｍ發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的接合現(xiàn)象,這是細(xì)菌的有性繁殖方式。此后不久，便弄清了這種接合是兩種不同的交配型(接合型）,遺傳信息總是從供體（雄性）轉(zhuǎn)移到受體(雌性）。當(dāng)兩種不同的交配型的細(xì)菌相互識別和接合以后，雄性細(xì)胞的致育因子，通過細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)傳遞到雌性細(xì)胞,這種致育因子后來稱為Ｆ因子。1952年，Lｅderberｇ指出，細(xì)菌的F因子與高等生物細(xì)胞質(zhì)中染色體外的遺傳單元極為相似，并正式提出了“質(zhì)?！边@一名稱，以區(qū)別于染色體的遺傳單元.一般來講，質(zhì)粒是細(xì)胞中能夠獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子，并在細(xì)胞分裂時能穩(wěn)定傳遞給子代細(xì)胞。雖然質(zhì)粒對細(xì)胞的生存沒有影響，但質(zhì)粒ＤNA上也有一些編碼基因，賦予宿主細(xì)胞一些特性.自發(fā)現(xiàn)能賦予細(xì)菌性別特征的F因子以后,又在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠編碼抗菌物質(zhì)-—大腸桿菌素的Col質(zhì)粒，包括CｏｌB，ＣolV,ColE等。由這些因子產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)稱細(xì)菌素（bacｌeｒiocｉn）,是細(xì)菌所合成的一種蛋白質(zhì),對于同種或近緣種具有毒性。合成細(xì)菌素的能力和對于細(xì)菌素的抗性，都由染色體外的遺傳因子所控制。在1９５9一1960年間,日本科學(xué)家在研究用強(qiáng)效抗生素治療菌痢患者時,發(fā)現(xiàn)病原菌志賀氏菌含有使其同時能抗幾種抗生素的基因，而且,這種抗藥性基因能以和Ｆ因子非常相似的方式轉(zhuǎn)移給其他腸道細(xì)菌,這就是抗藥因子（Ｒ因子）.抗藥因子（ｒesｉｓtanｃefactoｒ)實(shí)際上是控制細(xì)菌抗藥性的一種質(zhì)粒，能在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，由抗藥性轉(zhuǎn)移因子和抗藥性基因兩部分組成。每個抗藥因子上常具有幾個抗藥性基因。（二）質(zhì)粒DNA的基本性質(zhì)大多數(shù)質(zhì)粒ＤNＡ是是環(huán)狀雙鏈的DNA分子。如果兩條鏈都是完整的環(huán)，這種質(zhì)粒ＤNA分子稱為共價閉合環(huán)狀DNA(ｃｏvalentlｙclosｅｄcircuｌar,CＣCDNA）。CCCDNA有兩種構(gòu)型,超螺旋DNＡ(sｕpｅrcoｌｉedＤNA，SCDNＡ)和松弛的DNA(RelａxedDNA），分別是由ＤNA促旋酶(DNAｇyｒasｅ)和拓樸異構(gòu)酶（topoisoｍerase）作用的結(jié)果。如果質(zhì)粒DNA中有一條鏈?zhǔn)遣煌暾?，那么這種DNA分子就稱為開環(huán)的（opeｎｃircleｓ，OCＤNA），開環(huán)的ＤＮＡ通常是由內(nèi)切酶或機(jī)械剪切造成的圖3—8).從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DＮA時，質(zhì)粒DNＡ常常會轉(zhuǎn)變成超螺旋的構(gòu)型。圖３—8質(zhì)粒ＤNA的三種構(gòu)型(引自O(shè)ld＆Ｐrimrose,1９８0)溴化乙啶（etｈｉdiumｂromide,EtBｒ）是一種扁平的分子，能夠插入到DNＡ分子的堿基對之間，引起雙螺旋的部分解旋，從而改變了DNA的體積和密度。圖3—９相對分子質(zhì)量相同構(gòu)型不同的質(zhì)粒DNＡ的瓊脂糖凝膠電泳（引自O(shè)ld&Primrosｅ，1980)由于不同構(gòu)型的ＤNA插入EB的量不同，它們在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率也不同,CCＣDNA的泳動速度最快，ＯＣDNA泳動速度最慢，LDNA居中(圖3-9）,所以很容易通過凝膠電泳和EB染色的方法將不同構(gòu)型的DNＡ分別開來。（三）質(zhì)粒分類根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒。質(zhì)?？截悢?shù)(ｐｌasmidcopｙｎumbｅｒs)是指細(xì)胞中單一質(zhì)粒的份數(shù)同染色體數(shù)之比值,常用質(zhì)粒數(shù)/每染色體來表示。不同的質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同,?松弛型質(zhì)粒（ｒｅlaxｅｄplasmid）的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約,因而有較多的拷貝數(shù).通?？蛇_(dá)10—15個/每染色體。并且可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增，有的質(zhì)粒擴(kuò)增后,可達(dá)到3００0/每染色體(ColE１，可由24個達(dá)到1000至3０00個）。這類質(zhì)粒多半是分子量較小，不具傳遞能力的質(zhì)粒?；蚬こ讨惺褂玫亩嗍撬沙谛唾|(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒(strinｇeｎｔplａｓｍiｄ)在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身的復(fù)制機(jī)構(gòu)的控制外,還受染色體的嚴(yán)緊控制，因此拷貝數(shù)較少,一般只有1-２個/每染色體。這種質(zhì)粒一般不能用氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增。嚴(yán)緊型質(zhì)粒多數(shù)是具有自我傳遞能力的大質(zhì)粒.質(zhì)粒的復(fù)制特性是受復(fù)制子控制的.基因工程中使用的質(zhì)粒多數(shù)是松弛性質(zhì)粒載體。(四)載體的條件就克隆一個基因（DＮA片段)來說,最簡單的質(zhì)粒載體也必需包括三個部分（圖３-10)∶復(fù)制區(qū)，含有復(fù)制起點(diǎn);選擇標(biāo)記,主要是抗性基因;克隆位點(diǎn)，便于外源ＤNA的插入.就復(fù)制特性來講，要求載體必需有獨(dú)立的復(fù)制起點(diǎn),最好是松弛型復(fù)制，這樣便于得到大量的拷貝.有時需要有多個復(fù)制起點(diǎn)，能夠在不同的宿主細(xì)胞中復(fù)制,擴(kuò)大宿主范圍。具有合適的克隆位點(diǎn),便于外源DNA的插入?？寺∥稽c(diǎn)實(shí)際上限制性酶切位點(diǎn),最好是具有多種限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)，這樣適應(yīng)性強(qiáng)，克隆方便,如果一種酶在載體上有多個切點(diǎn)，就會限制該切點(diǎn)的使用.具有可檢測的選擇標(biāo)記,也是一個重要的基本條件，這種選擇標(biāo)記最好是能夠賦予宿主易于檢測的表型.選擇標(biāo)記就是常說的報告基因(reporｔgenes），包括抗生素抗性標(biāo)記,以及一些生化表型的標(biāo)記.另外，一個理想的質(zhì)粒載體必需具有低分子量，因?yàn)樾》肿拥馁|(zhì)粒DNＡ易于操作,不容易被損傷，也容易被分離純化。一般說小分子量的質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)比較高，酶切位點(diǎn)也少。圖3-1０質(zhì)粒載體的基本結(jié)構(gòu)二、雜合載體除了質(zhì)粒載體外,噬菌體的ＤNA也可作為載體,不過都是改造過的，自然病毒的ＤNA不能作為載體。目前在基因工程中使用的載體大多是質(zhì)粒和噬菌體的雜合載體。（一)柯斯質(zhì)粒(coｓmid)載體ｃｏsmid是英文cosｓite-ｃａrrｙiｎgplasｍｉd的縮寫，本意是帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒,因此，柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有λDＮA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體.柯斯質(zhì)粒的構(gòu)建一般都是利用質(zhì)粒的復(fù)制子、選擇標(biāo)記，加上λ的coｓ位點(diǎn)序列及與包裝有關(guān)的序列，構(gòu)建的科斯質(zhì)粒可以很好地用于基因克?。▓D3—1１）。圖3—11柯斯質(zhì)粒載體克?。ㄒ訪ｏdｉshetal，1９86）早期構(gòu)建的科斯質(zhì)粒載體有一些不足，如克隆位點(diǎn)較少,抗性標(biāo)記單一，容栽能力不大,后來進(jìn)行了一些改進(jìn),克服了這些不足.柯斯質(zhì)粒具有如下特點(diǎn):具有質(zhì)粒復(fù)制子。目前構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒大多具有pMＢ1復(fù)制子或ColＥ1復(fù)制子，所以進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠象質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制,并且能夠被氯霉素擴(kuò)增。具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記.如果在這些標(biāo)記中有克隆位點(diǎn)的話可用插入失活法進(jìn)行篩選。例如上面構(gòu)建的MuA—３就具有四環(huán)素抗性基因。具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。由于柯斯質(zhì)粒具有λDNA的cos位點(diǎn)和相應(yīng)的包裝序列，因此在克隆了適當(dāng)大小的外源ＤＮA以后可以被包裝進(jìn)入噬菌體蛋白顆粒,并能進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力比純的質(zhì)粒大3個數(shù)量級。進(jìn)入寄主細(xì)胞后，又可以自我環(huán)化。但它不能同寄主的染色體DNA整合，也不會產(chǎn)生子代噬菌體裂解寄主.溶載能力大。這是柯斯質(zhì)粒的最大優(yōu)點(diǎn).被克隆的DNＡ大小具有上限和下限，這是因?yàn)榭滤官|(zhì)粒最后是被包裝到噬菌體顆粒，它的最后大小應(yīng)在噬菌體基因組的75％-105％之間.由于載體分子一般在5kb左右，所以克隆的最大片段在45kb；如果載體的分子量為15kb的話,克隆的最小片段為１9kb。因此柯斯質(zhì)粒適合構(gòu)建真核生物的基因庫，而不適合克隆原核生物的基因。（二）ｐＵC載體系列的構(gòu)建美國加州大學(xué)的Vｉｅｉra和Mｅsｓinｇ利用pＢＲ322和M１３載體的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建了一個更小的載體,稱為pUC7(圖3-12），并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了pUC載體系列。圖3-12pＵC載體的構(gòu)建(引自Wiｎnａcker，1987)pUC載體具有很多優(yōu)點(diǎn)∶①多克隆位點(diǎn);②松弛復(fù)制；③有氨芐青酶素抗性;④可通過化學(xué)顯色篩選?，F(xiàn)在最常用的pUC載體是ｐＵＣ1８(圖3-13），它的分子量小，具有多克隆位點(diǎn)和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制,在正常情況下，它的拷貝數(shù)可達(dá)上千個,所以不需要用氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增.圖3—13ｐUC18質(zhì)粒載體圖譜二、基因文庫技術(shù)基因文庫（GeneLｉｂrary)是指在一種載體群體中，隨機(jī)地收集著某一生物DNA的各種克隆片段，理想地包含著該物種的全部遺傳信息（圖3—18）.因此，基因文庫是人工構(gòu)建的某一生物基因的“活期儲蓄所”，根據(jù)構(gòu)建方法的不同,分為基因組文庫、ｃDNA文庫等.根據(jù)基因庫的含量,又分為全庫和特異性的庫，全庫含有某一生物的全部遺傳信息，而特異性的庫是不完整的,如差示庫.早期將通過構(gòu)建基因文庫來篩選所需克隆的方法稱為鳥槍法.圖３-18基因文庫技術(shù)（J。J．Greenｅ&RａoV.B．，19９8)第三節(jié)體外重組一、體外重組的方法DNＡ重組連接的方法大致分為四種:粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法。1.粘性末端連接法粘性末端連接（Cohesiｖeenｄｌiｇａt(yī)ion）是指具有相同粘性末端的兩個雙鏈DＮA分子在DNＡ連接酶的作用下，連接成為一個雜合雙鏈DNA（圖3－14）.粘性末端可由識別回文序列的內(nèi)切酶所產(chǎn)生，或是用末端轉(zhuǎn)移酶來制備。凡是識別回文序列的內(nèi)切酶切割ＤNＡ產(chǎn)生的末端都是粘性末端，只有用同一種酶切割產(chǎn)生的相同粘性末端才能通過末端單鏈的堿基配對并在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接.圖3—14黏性末端連接法(引自Ｓnyｄer＆Ｃhａmｐneｓs，1９７7）粘性末端連接法是最常用的DNA連接方法，酶切片段基本不需作什么處理就可以用于連接,既經(jīng)濟(jì)又省時.由于大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都可以產(chǎn)生粘性末端，操作方便。另外,通過粘性末端連接的重組體，其外源片段很容易回收，只要用原來的酶切割重組體就可以了.另外，也可以通過雙酶切來獲得黏性末端，并可進(jìn)行定向重組連接（圖3—1５).圖3-15雙酶切進(jìn)行定向重組連接（引自Ｓnyｄeｒ＆Chamｐnｅss,１97７)平末端連接(ｂlｕnteｎｄliｇａt(yī)ion)是指在T４DNA連接酶的作用下(可加入適量的ＲＮA連接酶）,將兩個具有平末端的雙鏈DＮA分子連接成雜種DNA分子。平末端連接的效率比粘性末端連接的效率低得多，所以通常在連接反應(yīng)體系中要適量添加促進(jìn)大分子凝聚的凝聚劑,以提高平末端DNＡ連接的效率.常用的是PEＧ8000，加入后,可以起到兩個作用：一是可將平末端連接的效率提高1－3個數(shù)量級;二是改變連接產(chǎn)物的分布,抑制分子內(nèi)的連接，促進(jìn)分子間的連接,得到的連接產(chǎn)物主要是重組體。平末端連接的不利之處是連接效率低,需要大量的連接酶，有時為了提高連接效率，通常要補(bǔ)加ＲＮA連接酶。連接后,緣由的限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶的切點(diǎn)要消失,所以不易回收插入的外源ＤNA片段。3.同聚物加尾法所謂同聚物加尾（ｈomopolymertａilsjoｉninｇ)連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的３＇端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端,外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸,如dＡ(ｄG）和dT（dＣ）,然后在ＤNA連接酶的作用下，連接成為重組的DＮA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段，但方法較繁,需要λ核酸外切酶、Ｓ1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用（圖3-16)。同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法,具有很多優(yōu)點(diǎn)：①首先不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA的兩端的尾巴是相同的,所以不存在自身環(huán)化。②因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的粘性末端，所以連接效率較高。③用任何一種方法制備的ＤNＡ都可以用這種方法進(jìn)行連接，所以是一種通用的體外重組的方法。圖3－16同聚物尾連接法（引自O(shè)ｌd&Pｒimｒosｅ，1９８0）１．基因組DNＡ文庫所謂基因組文庫(genomｉcDＮAＬibrａry）,就是用基因工程的方法,人工構(gòu)建的含有某一生物基因組ＤNＡ的各種片段的克隆群。一般以改造的噬菌體ＤNA或柯斯質(zhì)粒作為載體，包括下列過程（圖3－19）：①高分子量染色體DNＡ的制備，②體外重組連接,③包裝蛋白的制備，④重組體的體外包裝,⑤將重組DNＡ導(dǎo)入寄主細(xì)胞，⑥篩選。建造基因組文庫不僅可以大量擴(kuò)增含量極少的單拷貝的結(jié)構(gòu)基因，也可以克隆調(diào)控基因,有利于研究基因的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機(jī)理?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇欤ǎ纾錸epooｌ)是指在行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中,由于使用的載體不同,分為噬菌體載體和柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAＣ文庫。圖3－1９基因組文庫技術(shù)（引自Grifｆithsetal．１996）2.cＤＮA文庫同mＲNA互補(bǔ)的ＤNA稱為cDNA。mRNＡ為模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化,也可用這種方法制備特異性的雜交探針。cＤNA文庫是以某一生物的總mRNA為模板,在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反向轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的ＤNA,即第一鏈,破壞RＭＡ模板后,再以第一鏈為模板合成第二鏈,得到的雙鏈DＮA稱為ｃDNA基因.選用適合的載體,將合成的ｃDNA基因重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的ｃＤNA基因的克隆群稱為ｃDNA文庫(cｏｍpletｅmｅntDNALiｂｒaｒy)(圖3－20).由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。圖3-２0cDNA文庫構(gòu)建(引自O(shè)lｄ＆Priｍrose,1９80)由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時間上并非是統(tǒng)一的,具有發(fā)育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNＡ文庫是不可能構(gòu)建得十分全,也就是說任何一個cＤNA文庫都不可能包含某一生物全部編碼基因。所以在構(gòu)建cＤNA文庫時應(yīng)根據(jù)研究目的的不同而選用不同的生物材料作為RNA分離的出發(fā)材料，有些甚至要經(jīng)過特殊的誘導(dǎo)處理以提高所需DNA的豐度.第五節(jié)重組DNA的轉(zhuǎn)移、篩選與鑒定轉(zhuǎn)化是基因工程操作中一項(xiàng)十分重要的工作。DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DＮＡ分子的轉(zhuǎn)化（tranｓformaｔioｎ)。重組體的篩選有兩層涵義,一是將攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來,二是將將攜帶有特定外源插入片段的重組體挑選出來。鑒定則是對篩選的重組體進(jìn)行最后的鑒別.一、重組DＮＡ的轉(zhuǎn)化能夠接受轉(zhuǎn)化作用的細(xì)菌的生理狀態(tài)叫感受態(tài).細(xì)菌的感受態(tài)是在適當(dāng)?shù)纳L條件下獲得的一種生理特征。要強(qiáng)調(diào)的是：感受態(tài)是有關(guān)轉(zhuǎn)化因子被吸收的生理狀態(tài)，而不是有關(guān)轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞后能否被接受的生理狀態(tài).處于感受態(tài)的受體細(xì)菌，其吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細(xì)菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細(xì)菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。在自然條件下，大多數(shù)類型的細(xì)菌不出現(xiàn)感受態(tài)，也不發(fā)生轉(zhuǎn)化。然而可以通過某些化學(xué)誘導(dǎo)的方法來制備感受態(tài),用這種方法得到的感受態(tài)就稱為人工誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞。目前常用的誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法是CａCl2法(圖3-２1)，此外也可以用基因槍等方法轉(zhuǎn)化外源DＮＡ.圖3－２1鈣誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化二、重組體的遺傳學(xué)篩選法所謂遺傳學(xué)方法(genｅticseｌｅcｔion)主要是根據(jù)受體細(xì)胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生的遺傳表型的變化直接選擇重組體的方法。遺傳表型的變化包括抗藥性、缺陷基因的功能互補(bǔ)表型及噬菌斑的變化等.這些表型的變化,有些是載體提供的表型特征，有些則是插入序列提供的表型特征。選擇的方法主要是根據(jù)平板上可見的表型變化,用于選擇的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達(dá)抗生素平板、顯色平板等,由于這些方法都是直接從平板上篩選，所以又稱為平板篩選法。(一）插入失活篩選法從原理上講，當(dāng)外源基因（或DNA片段）插入到某一基因內(nèi)的位點(diǎn)后，使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活(insｅrtiｏnaｌｉnactivａt(yī)iｏn)。圖3－２2插入失活的原理圖3－23聚合酶鏈反應(yīng)（引自Watsonetal,1９9２)1.抗性基因插入失活篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計的插入失活法是重組體常用的篩選方法。如非重組的ｐB(yǎng)R322質(zhì)粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的，表型為AprTcr。帶有這種質(zhì)粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是,如果在該質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入外援片段，就會造成四環(huán)素抗性基因失活,變成AprTcs,攜帶這種質(zhì)粒的宿主菌可以在氨芐青霉素的平板上生長，而不能在四環(huán)素抗性平板上生長(圖３－２２)。2。藍(lán)白斑篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計的插入失活法需要進(jìn)行菌落平板的影印復(fù)制,才能夠?qū)⑺璧闹亟M體挑選出來，大大增加了篩選的工作量.后來，人們設(shè)計了以β—半乳糖苷酶的產(chǎn)生作為顏色篩選標(biāo)記的載體,簡化了篩選程序，提高了靈敏度。這類載體系統(tǒng)包括M13噬菌體、ｐUC質(zhì)粒系統(tǒng)、pEGＭ質(zhì)粒系統(tǒng).它們的共同特點(diǎn)是載體上攜帶一段細(xì)菌的ｌaｃＺ基因，它編碼β-半乳糖苷酶的一段1４６個氨基酸的α—肽,載體轉(zhuǎn)化的受體菌為lａｃZΔM15基因型。這樣,載體同宿主通過互補(bǔ),具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DＮＡ，造成laｃZ基因失活,不能合成α-肽,失去同宿主的互補(bǔ)，不能形成有功能的β－半乳糖苷酶,失去分解Ｘ—ｇaｌ的能力。在X—gal平板上，含陽性重組體的細(xì)菌為物色菌落（質(zhì)粒載體）或無色噬菌斑(M１3噬菌體載體）;非重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為藍(lán)色菌落或藍(lán)色噬菌斑。顯色反應(yīng)篩選方法比較簡單,但是β－半乳糖苷酶的合成需要誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)中起誘導(dǎo)作用的是安慰誘導(dǎo)物－-IPTG（異丙基硫代—β－D-半乳糖苷),作用底物是Ｘ－gaｌ（5-溴—4－氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是將Ｘ－gａl和IPTG混合后,涂布在固體平板的表面。(二）PCＲ法聚合酶鏈反應(yīng)（poｌymerasｅchainｒeactｉon,PCR）是一種體外擴(kuò)增特定DＮA序列的新技術(shù)，這種ＤNA的體外擴(kuò)增是通過同DNＡ雙鏈互補(bǔ)的兩個引物在DNA聚合酶的作用下，進(jìn)行引物延伸來完成的。在反應(yīng)系統(tǒng)中，需要有：①模板（含有特定序列的DNA分子)。②兩個寡聚核苷酸引物，這兩個引物可同雙鏈DNA分子的互補(bǔ)鏈雜交，并且位于靶DＮA欲擴(kuò)增區(qū)的兩側(cè)。③耐熱DNA聚合酶。④4種脫氧核糖單核苷酸.然后經(jīng)過不同溫度的循環(huán)進(jìn)行ＤNA擴(kuò)增（圖3—23）.這一技術(shù)是KaryMulｌis在1985年發(fā)明的，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。ＰCR應(yīng)用十分廣泛，并且可通過菌液PｃR進(jìn)行重組克隆的快速篩選?；痉椒ㄊ菑目剐云桨迳咸羧尉浣臃N至25０μL的ＬB培養(yǎng)基中,20０ｒ／miｎ振蕩培養(yǎng)8h以后，取1μL菌液進(jìn)行裂解制備模板進(jìn)行PCR篩選。（三）核酸雜交篩選法核酸雜交又叫分子雜交（moleculａｒｈybridｉｚａt(yī)ion)，是鑒定和篩選重組體的一種方法。原理是：兩條具有堿基互補(bǔ)序列的ＤNＡ分子變性后，在溶液中一起進(jìn)行復(fù)性時,可以形成雜種雙鏈ＤNA分子。同樣,一條DNＡ鏈與之具有互補(bǔ)堿基序列的RＮA鏈在一起復(fù)性時，也能形成雙鏈結(jié)構(gòu)（DＮA－RNA雜交體）。雜交包括下列過程:①DNA的“熔解”,即變性,目的是使雙螺旋解開成為單鏈,這可將DNA溶液的溫度升高超過Tm值(解鏈溫度）即可；②退火，即DNA的復(fù)性，將加熱過的ＤNA溶液緩慢冷卻即可發(fā)生。雜交的雙方是待測的核苷酸序列及探針.待測核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未經(jīng)克隆的基因組DNA或是細(xì)胞總ＲNA。核酸雜交方法的兩個特點(diǎn)是高度特異性及高度靈敏性.1．菌落雜交在大量篩選重組的細(xì)菌細(xì)胞時,需要從中尋找出為數(shù)極少的含有目的序列的細(xì)胞。另外。在利用插入失活、顯色反應(yīng)等手段得到含重組質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞后，還需要證明這些重組質(zhì)粒是否含所需要的目的序列。若將所得菌落逐個擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒ＤＮA，然后用Ｓｏuthern雜交法固然可以鑒定重組質(zhì)粒，不僅工作量大，又耗費(fèi)財力,用菌落雜交（colonyhybridizatioｎ)（圖3—24)，就方便得多。首先要將轉(zhuǎn)化的受體菌在合適的瓊脂平板上制成單菌落，然后將菌落復(fù)制到硝酸纖維素濾膜上,保留主平板，將硝酸纖維素濾膜上的菌落進(jìn)行原位溶菌、原位釋放ＤＮA、原位進(jìn)行ＤNA變性、中和洗滌后進(jìn)行原位固定。然后同特異的探針進(jìn)行雜交，通過放射自顯影后,有雜交信號的即為重組體，對照主平板則可將重組體選擇出來.圖３—24菌落雜交的基本過程（引自O(shè)lｄ＆Primrose，１9８0)2.Sｏuｔｈern雜交Sｏuｔｈerｎ雜交（Soｕtherｎｈybrｉｄizaｔion）是1975年Southｅrn建立起來的一種雜交方法，屬固相-液相雜交。該法的主要特點(diǎn)是利用可毛細(xì)現(xiàn)象將ＤNＡ轉(zhuǎn)移到固體支持物上,稱為Soｕtheｒn轉(zhuǎn)移或Souｔhern印跡（Ｓｏｕtｈernｂlottinｇ）。它首先用合適的限制性內(nèi)切酶將DNA切割后，進(jìn)行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體經(jīng)過凝膠,從而使DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面,然后進(jìn)行雜交（圖３—25）。圖3-２５Sｏｕｔheｒn雜交中的DＮA轉(zhuǎn)移（引自Aｌｂertsetal.2002)3．Nｏｒtｈern雜交Northｅrn雜交（NｏrｔheｒnＨｙbｒidizａt(yī)ion）是分析ＲNA的一種方法,它的基本原理是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,再轉(zhuǎn)移到尼龍膜等固相膜載體上,用放射性同位素標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對固定于膜上的mRNA進(jìn)行雜交,洗膜去除非特異性雜交信號,經(jīng)放射自顯影，對雜交信號進(jìn)行分析.將雜交的mRNＡ分子在電泳中的遷移位置與標(biāo)準(zhǔn)分子量分子進(jìn)行比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小，對雜交信號的強(qiáng)弱比較,可以知道該基因表達(dá)mＲNA的強(qiáng)弱。這一技術(shù)應(yīng)用十分廣泛,常用于基因表達(dá)調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)與功能、遺傳變異及病理研究。主要用來檢測外源基因在受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄成RNA。

Ｎｏrｔｈern印跡的原理同Ｓoｕthern印跡.但有兩點(diǎn)不同:其一是轉(zhuǎn)移的對象不同，Norｔherｎ印跡是將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。其二,雖然RNＡ電泳前不需向DNA那樣進(jìn)行酶切,但也需要變性。不過變性方法是不同的，它不能用堿變性，因?yàn)閴A變性會導(dǎo)致RＮA的水解.?Noｒthern雜交與Soｕｔｈeｒn雜交的主要區(qū)別是在變性劑存在下，用瓊脂糖進(jìn)行電泳分離ＲNA。變性劑的作用是防止RNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)夾環(huán)的形成,保持其單鏈線性狀態(tài).第六節(jié)生物技術(shù)及應(yīng)用基因工程技術(shù)的發(fā)展推動了生物技術(shù)(bｉoteｃ}lnokogy）的發(fā)展，現(xiàn)代生物技術(shù)作為一門綜合性的學(xué)科，與現(xiàn)代微生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和化學(xué)工程等多學(xué)科密切相關(guān)。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)從２0世紀(jì)８0年代開始起步，經(jīng)過20年的發(fā)展，目前在農(nóng)牧業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用.生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)市場逐漸形成，其前景廣闊,將成為21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。(一)細(xì)胞工程細(xì)胞工程(ｃｅllenginｅｅrｉng）是利用細(xì)胞的全能性，在細(xì)胞或細(xì)胞器水平上改變細(xì)胞的某些遺傳特性,以改良其性狀、獲得有用基因產(chǎn)物或加速細(xì)胞及生物體繁殖的綜合技術(shù),可分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動物細(xì)胞工程，是以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ),通過細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、動物克隆、染色體工程和生物反應(yīng)器來實(shí)現(xiàn)。1．細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cｅllfｕｓiｏn)又稱體細(xì)胞雜交(sｏmaｔicｈｙbｒidizatioｎ），是指兩個不同來源的細(xì)胞，彼此融合成雜交細(xì)胞,使來自兩個親本細(xì)胞的基因有可能都被表達(dá)，打破遠(yuǎn)緣生物不能雜交的屏障，形成新物種或新品種的技術(shù)。1９75年，英國劍橋大學(xué)的科學(xué)家科萊爾(G．Kohｌｅr）和米爾斯坦(C。Milｓtｅｉn)用細(xì)胞融合技術(shù)將能分泌抗體的B淋巴細(xì)胞(綿羊紅細(xì)胞、免疫小鼠脾細(xì)胞）與具有無限生長能力的腫瘤細(xì)胞（小鼠骨髓瘤細(xì)胞）融合，得到了既能持續(xù)產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限繁殖的雜合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞，hyｂridomaｃell)(圖３—2６)，通過細(xì)胞培養(yǎng)將雜合細(xì)胞克隆為單純的細(xì)胞系（單克隆系),由此類細(xì)胞系可獲得結(jié)構(gòu)和特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（moｎoｃlonalanｔibody，ＭcＡb)。這一技術(shù)的創(chuàng)立在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得重大突破，兩位科學(xué)家因而榮獲１9８４年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。圖3—26利用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體(引自Kuby，1９9４)如今這種細(xì)胞融合技術(shù)已在動物間實(shí)現(xiàn)了小鼠和田鼠,小鼠和小雞，甚至于小鼠和人等許多遠(yuǎn)緣和超遠(yuǎn)緣的體細(xì)胞雜交。雖然目前動物的雜交細(xì)胞還只停留在分裂傳代的水平，不能分化發(fā)育成完整的個體，但在理論研究和基因定位上都有重大意義。而植物間的細(xì)胞融合所得到的雜交細(xì)胞,獲得了新的雜交植物，如西紅柿與馬鈴薯細(xì)胞融合獲得“西紅柿馬鈴薯”，羽衣甘藍(lán)與白菜型油菜細(xì)胞融合得到“甘藍(lán)型油菜"等.２．細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植是將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的顯微操作技術(shù).由于主要遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核內(nèi)，因而此技術(shù)可獲得遺傳上具同質(zhì)性狀的動物,對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動物的傳種具有重大意義。1952年,美國科學(xué)家布里格斯（R．Ｂrigｇs）首次利用豹紋蛙卵細(xì)胞建立了細(xì)胞核移植技術(shù).1981年，瑞士科學(xué)家Ｋ．111menses率先對哺乳動物小鼠卵細(xì)胞進(jìn)行核移植獲得成功。他將灰鼠的細(xì)胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵內(nèi),然后再將這一f'Ｆh黑鼠細(xì)胞質(zhì)和灰鼠細(xì)胞核組成的卵細(xì)胞體外培養(yǎng),得到的仔鼠是灰色的，說明仔鼠的性狀取決于細(xì)胞核的來源。在細(xì)胞核移植技術(shù)上發(fā)展起來的動物體細(xì)胞克隆技術(shù)在1997年因克隆羊“多莉”（Doｌlｙ)的誕生而取得了重大突破.英國科學(xué)家維爾穆特（I．ｗilmｕt)等1９9７年２月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆過程(圖3—27）.他們?nèi)〕隽g的芬蘭多塞特白綿羊母羊的乳腺細(xì)胞核,將此核導(dǎo)入蘇格蘭黑綿羊去核的卵細(xì)胞內(nèi)，待手術(shù)完成之后，以相同頻率的電脈沖刺激換核卵，讓蘇格蘭黑綿羊的卵細(xì)胞質(zhì)與芬蘭多塞特白綿羊母羊乳腺細(xì)胞的核相互協(xié)調(diào),使這個“組裝”細(xì)胞在體外發(fā)育成早期胚胎，然后將胚胎植入另一只母羊的子宮內(nèi)，產(chǎn)下了小綿羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵細(xì)胞和公羊的精細(xì)胞受精的產(chǎn)物,而是體細(xì)胞核加去核的卵細(xì)胞質(zhì),不經(jīng)兩性結(jié)合誘導(dǎo)出來的胚胎產(chǎn)生的?！翱寺⊙?的誕生表明：動物體中執(zhí)行特殊功能、具有特定形態(tài)的所謂高度分化的細(xì)胞與受精卵一樣具有發(fā)育成完整個體的潛在能力。圖３—27克隆羊“多莉”誕生的過程（引自Gｌiｃｋ&Pasternak,1998）19９8年,日本科學(xué)家利用成年動物體細(xì)胞克隆的兩頭牛犢誕生;同年,美國科學(xué)家用成年鼠的體細(xì)胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1９99年,夏威夷大學(xué)的科學(xué)家利用成年鼠體細(xì)胞克隆出第一只雄性老鼠;2000年１月，美國科學(xué)家宣布克隆猴成功，這只恒河猴被命名為“泰特拉"；同年3月，曾參與克隆小羊“多莉”的英國PPL公司宣布,他們成功培育出５頭克隆豬。200２年,我國科學(xué)家成功克隆出牛和山羊，使我國成為少數(shù)掌握體細(xì)胞克隆哺乳動物關(guān)鍵技術(shù)的國家之一.2０03年，美國、意大利等國科學(xué)家分別培育出世界上第一匹克隆騾子和克隆馬。中國和法國科學(xué)家合作首次克隆出大鼠。（二）蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是根據(jù)分子設(shè)計的方案,通過對天然蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造，來實(shí)現(xiàn)對其所編碼的蛋白質(zhì)的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì),而是經(jīng)過改造的,具有了人類所需要特性的特殊蛋白質(zhì).天然蛋白質(zhì)都是通過漫長的進(jìn)化過程自然選擇而來的,而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)的改造，能更快、更有效地為人類服務(wù)。重組人ｐ干擾素（IFNp）的人工改造是蛋白質(zhì)工程的一個成功范例。干擾素（ｉntｅrｆｅroｎ)是人體細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分.重組人IＦNβ是采用重組DNA技術(shù)，克隆人β干擾素基因，構(gòu)建合成干擾素的基因工程菌,經(jīng)發(fā)酵、提純、純化制備而成。其基因工程產(chǎn)物活性為10萬U／mg,僅是天然IFＮ口產(chǎn)物活性的１０%.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，人IFNβ由154個氨基酸組成，在１7、41、141位有3個半胱氨酸(Ｃys）,人體天然產(chǎn)物在4１、14１間形成二硫鍵，基因工程產(chǎn)物二硫鍵位置有偏差，17位Cyｓ的巰基參與二硫鍵,形成無活性的二聚體或寡聚體.由于絲氨酸（Ser）與半胱氨酸在結(jié)構(gòu)上除羥基（-OH)與巰基(-ＳH）外完全一樣，因此將１７位Cys點(diǎn)突變?yōu)镾ｅr，結(jié)果證明人工改造的IFN口產(chǎn)物活性提高１00倍,穩(wěn)定性好于天然產(chǎn)物。(三）酶工程酶工程（eｎzymeengineerinｇ)就是通過對酶的修飾改造,提高酶的催化效率并在某一生物反應(yīng)器中大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)過程，主要包括酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶的分離純化、酶分子修飾、酶和細(xì)胞固定化、酶反應(yīng)動力學(xué)與反應(yīng)器、酶的應(yīng)用等。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中(表3—4).例如,固定化青霉素?；赣糜谶B續(xù)裂解青霉素生產(chǎn);α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶連續(xù)作用于淀粉,就可以生產(chǎn)出各類糖漿;利用葡萄糖苷酶可生產(chǎn)出低糖啤酒;蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，軟化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生產(chǎn)的嫩肉粉等,都是酶工程的產(chǎn)物。此外，酶工程還用于農(nóng)副產(chǎn)品的加工利用。美國利用大豆生產(chǎn)出2０0余種產(chǎn)品,包括營養(yǎng)食品、藥品、食品添加劑等，例如高純度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工業(yè)生產(chǎn)的酶有６０余種,其中規(guī)?；a(chǎn)僅２０余種.表３—4酶工程的主要應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域酶類主要用途食品工業(yè)淀粉酶類葡萄糖、麥芽糖生產(chǎn),啤酒釀造，面包、餅干等,烘烤食品制作等蛋白酶類嫩肉粉、餅干、蛋白胨、乳酪生產(chǎn),啤酒澄清，肉類加工（如香腸熟化等）糖化酶淀粉液化，糊精降解葡萄糖異構(gòu)酶高果糖漿生產(chǎn)葡萄糖苷酶低糖啤酒生產(chǎn)凝乳酶乳酪生產(chǎn)果膠酶果酒、果汁去濁紡織工業(yè)淀粉酶類紡織品褪漿纖維素酶處理纖維制品，提高棉毛紡織品質(zhì)量蛋白酶類絲制品脫膠處理日化工業(yè)蛋白酶類加酶洗滌劑、加酶護(hù)膚品與化妝品生產(chǎn)淀粉酶類加酶洗滌劑生產(chǎn)超氧化物歧化酶化妝品生產(chǎn)糖酐酶牙膏添加劑制革工業(yè)蛋白酶類皮革去毛、軟化醫(yī)藥工業(yè)青霉素酰化酶青霉素、頭孢霉素生產(chǎn)羥化酶氫化可的松生產(chǎn)酪氨酸酶多巴(主治帕金森?。┥a(chǎn)蛋白酶類氨基酸、蛋白水解液生產(chǎn)，治療消化不良，消腫,降壓等葡萄糖腦苷酯酶治療高雪病(葡萄糖腦苷酯酶缺乏癥)天冬酰胺酶治療白血病溶菌酶消炎,鎮(zhèn)痛，止血等尿激酶治療心肌梗死、結(jié)膜出血等超氧化物歧化酶治療紅斑狼瘡、皮肌炎、輻射損傷等鏈激酶治療血栓性靜脈炎、血腫等其他多種酶多種疾病診斷(如葡萄糖氧化酶診斷糖尿病，膽堿酯酶診斷肝炎等）環(huán)保工業(yè)淀粉酶類處理造紙工業(yè)廢水溶菌酶處理高有機(jī)物含量廢水丁酸梭菌酶系處理釀酒工業(yè)廢水其他多種酶環(huán)境監(jiān)測試劑（如膽堿酯酶監(jiān)測有機(jī)磷農(nóng)藥,硫氰酸酶監(jiān)測氰

化物等)(四）發(fā)酵工程發(fā)酵工程(fｅrmｅntａt(yī)ioｎenｇineeｒinｇ）是利用微生物的特性，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)，在反應(yīng)器中生產(chǎn)目的產(chǎn)物或提供所需服務(wù)的技術(shù)過程.“發(fā)酵”一詞來源于拉丁語動詞ferｖerｅ（發(fā)泡），意指利用酵母以果汁或麥芽汁為原料生產(chǎn)酒精飲料時出現(xiàn)的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)有悠久的歷史，早在幾千年前人類就利用有益的微生物生產(chǎn)食品和藥物，如酒、醋、醬、奶酪等?，F(xiàn)代發(fā)酵工程是在傳統(tǒng)發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程、細(xì)胞工程、酶工程等現(xiàn)代高新技術(shù)發(fā)展而成，由于其主要以微生物培養(yǎng)為主，因而也稱微生物工程.發(fā)酵工程由3部分組成(圖3-2８）：上游工程、發(fā)酵過程和下游工程。其中上游工程包括優(yōu)良菌株的選育、最適發(fā)酵條件(pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成)的確定、營養(yǎng)物的準(zhǔn)備等.發(fā)酵過程主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。這里要有嚴(yán)格的無菌生長環(huán)境,包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進(jìn)行滅菌的技術(shù)，在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù),在發(fā)酵過程中根據(jù)細(xì)胞生長要求控制加料速度的計算機(jī)控制技術(shù),還有種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。圖3-28發(fā)酵工程的基本流程微生物發(fā)酵產(chǎn)品可分為以下幾大類:微生物細(xì)胞(生物量）作為產(chǎn)品,如單細(xì)胞（酵母）蛋白作為食品或飼料。微生物代謝物產(chǎn)品，目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素等已有近20０個品種,絕大部分都是發(fā)酵產(chǎn)品.此外，發(fā)酵產(chǎn)品還包括酒精、氨基酸、檸檬酸和工業(yè)用酶等。味精、多種維生素等也是發(fā)酵工程的產(chǎn)品。基因工程產(chǎn)品.微生物(如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌和酵母等)是最常用的重組基因的表達(dá)系統(tǒng)。主要產(chǎn)品包括干擾素、胰島素、牛凝乳酶、G—ＣSF(粒細(xì)胞集落刺激因子）、ＥPO（紅細(xì)胞生成素）和tＰA（重組組織型纖溶酶原激活劑）等。（五）生物醫(yī)學(xué)工程生物醫(yī)學(xué)工程（ｂiomediｃalenｇiｎeerinｇ)是綜合生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和工程學(xué)的理論和方法而發(fā)居起來的新興綜合學(xué)科.生物醫(yī)學(xué)工程開始以仿生學(xué)原理制造人工器官,如心臟起搏器、人造心臟、假肢等,以及用于診療手段的醫(yī)學(xué)儀器。后來人體器官移植成為醫(yī)療中可以選擇的手段，但常常要克服異體器官的排斥反應(yīng)，在用藥物能夠解決排斥反應(yīng)之前，人體器官移植成功的例子很少.由于生物技術(shù)迅猛發(fā)展,在ＤNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)5０年后,人類基因組計劃已經(jīng)完成，對人類基因全面了解后，人們已經(jīng)將眼光投到干細(xì)胞克隆和治療性克隆(非生殖性克隆),一些國家如美國建立了胚胎的干細(xì)胞系，用于包括治療性克隆等方面的研究.國外已經(jīng)成功地從自體鼻窿腔內(nèi)取出干細(xì)胞，導(dǎo)人心臟,去除心臟因炎癥等留下的疤痕,恢復(fù)了心臟的正常功能，以及用血液中的干細(xì)胞修復(fù)因車禍等造成四肢癱瘓患者的脊髓神經(jīng)，使他們重新站立起來.這是因?yàn)榧幢闶浅扇耍恍┰谂咛r期存在的干細(xì)胞仍可以留存在身體的各部分，或者作為專能干細(xì)胞，也在人體的器官中，這些干細(xì)胞能夠在特定的情況下進(jìn)一步分化為組織。利用自體的干細(xì)胞也免除了異體器官移植糟糕的排斥反應(yīng)。這種利用人體自身干細(xì)胞修復(fù)人體受損部分已經(jīng)成功的例子以及治療性克隆的前景,為解除人類的病痛帶來了福音。（六）生物信息工程生物信息工程（bｉoｌogicaｌinfｏrmaｔioｎｅngｉneering)可以簡單地定義為計算機(jī)與信息技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用,它是一個年輕和快速發(fā)展的領(lǐng)域.生物信息工程運(yùn)用數(shù)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)來闡明和理解大量生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中所包含的生物學(xué)意義，包括此類數(shù)據(jù)的采集、貯存、整理、歸檔、分析與可視化等.以人類基因組計劃(ｈumangenｏmeprojｅct,HGP）為序幕的生物信息學(xué)研究,是全面認(rèn)識生命及其過程的重要手段，由此引發(fā)的生物信息革命，將從根本上改變生命科學(xué)和生物產(chǎn)業(yè)的思維方式和研究體系。人類基因圖譜繪制既是生物學(xué)的突破也是計算科學(xué)的壯舉。在生物學(xué)家看來，存在于基因組中的堿基對序列是寶貴的生物信息資源,是未來生物工程產(chǎn)業(yè)的支柱。人類３萬~4萬個基因的信息以及相應(yīng)的染色體位置被闡明后，將成為醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)知識和技術(shù)創(chuàng)新的源泉。一些困擾人類健康的主要疾病，例如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、癌癥、老年癡呆癥等都與基因有關(guān),可以依據(jù)已知的基因序列和功能，找出這些基因并針對相應(yīng)的靶位進(jìn)行藥物篩選,并設(shè)計新藥。到2０02年底，已有15０0多種致病基因被標(biāo)記。信息技術(shù)有史以來首次成為推動實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要動力.這一趨勢明顯地表現(xiàn)在所有與了解疾病起因、新藥開發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵領(lǐng)域中-—基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝途徑的研究等，這些專業(yè)的研究需要依靠強(qiáng)大的計算機(jī)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)和存儲管理系統(tǒng)來完成大量的數(shù)據(jù)處理工作。而這些對生命的研究數(shù)據(jù)將幫助人類解開人體內(nèi)數(shù)以萬計蛋白質(zhì)種類的基因編碼秘密.此外,利用生物信息工程技術(shù)建立動、植物良種及相關(guān)有用基因數(shù)據(jù)庫將有助于各種家畜、作物的基因改良。四、轉(zhuǎn)基因動物圖3-３0轉(zhuǎn)基因鼠(引自Gｒiffithsetal,1999)傳統(tǒng)的家畜改良主要是通過多代選擇性交配改良飼養(yǎng)動物的遺傳性狀，如產(chǎn)奶、羊毛品質(zhì)、生長速度和產(chǎn)蛋率等.在每一輪連續(xù)世代中，那些具有優(yōu)越性狀的動物可作為選育良種。這種交配、選育的方式雖然費(fèi)時、費(fèi)力，但卻很成功,現(xiàn)今幾乎所有的家畜都經(jīng)過這種改良。但是這種方法不能將單一的功能基因或基因簇引入高等動物的染色體DNＡ上。經(jīng)過20世紀(jì)80年代不懈的努力，借助于受精卵原核顯微注射和早期胚胎細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒感染等手段,將基因?qū)胧芫旬a(chǎn)生新品種的設(shè)想已成為現(xiàn)實(shí)。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速成為研究哺乳動物基因表達(dá)和發(fā)育的有效手段,在建立研究人類疾病的動物模式系統(tǒng)中發(fā)揮著作用，還可以使動物的乳腺分泌含有藥用蛋白的乳汁，因而出現(xiàn)了“乳腺生物反應(yīng)器"。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小鼠的研究中發(fā)展得較為成熟(圖3—3０）。20世紀(jì)８０年代以來，已經(jīng)將幾百種基因?qū)氩煌钠废抵?。這些研究使人們對基因調(diào)控、腫瘤發(fā)生、免疫專一性、發(fā)育的分子遺傳學(xué)及其他一些基本的生物活動過程有了更多的了解。轉(zhuǎn)基因小鼠還可作為人類治療藥物的檢測動物,不同的轉(zhuǎn)基因品系可作為研究人類遺傳疾病的生物醫(yī)學(xué)模型。（一)基因?qū)雱游锏姆椒ㄔ谵D(zhuǎn)基因中,ＤNA可通過３種方式導(dǎo)入：①反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)感染早期胚胎細(xì)胞,然后植入雌性動物體內(nèi).②顯微注射到受精卵內(nèi)膨大的精核(雄性原核）中.③基因工程處理胚胎干細(xì)胞，導(dǎo)入一個早期發(fā)育胚胎后再植入雌性動物體內(nèi)。1．反轉(zhuǎn)錄病毒載體法圖３-３１顯微注射法進(jìn)行動物轉(zhuǎn)基因的基本過程（引自Ｇlｉcｋ&Pａsteｒnak,1９９8）在各種基因轉(zhuǎn)移方法中，反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體能夠有效地使轉(zhuǎn)移基因整合到受體細(xì)胞基因組中。但是,這類載體只能攜帶小片段(約8kb）ＤNA，因?yàn)殚L度的限制,這些轉(zhuǎn)移基因可能缺少關(guān)鍵的相鄰調(diào)控序列。使用病毒載體有一個最主要的缺陷，雖然這些載體被設(shè)計為復(fù)制缺陷型，但是用于制備大量載體DNＡ的病毒株的基因組可同樣進(jìn)入細(xì)胞核.除非采取特殊的預(yù)防措施,這些輔助病毒會在轉(zhuǎn)基因個體中復(fù)制、產(chǎn)生。無論是直接將轉(zhuǎn)基因個體作為食品，還是利用其產(chǎn)物,都應(yīng)絕對避免病毒的污染，所以，反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法很少用于生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)用途的轉(zhuǎn)基因動物。２．DNＡ顯微注射法由于反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法的不足，顯微注射DＮA成為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的首選方法。整個過程包括3個主要步驟（圖３-31）:①刺激供體雌性鼠超量排卵，以產(chǎn)生足夠的受精卵用于注射。首先注射孕馬血清,約48ｈ后再注射人絨毛膜促性腺激素，一只超量排卵的小鼠可產(chǎn)生大約３５顆卵，而不是通常的5~１０顆卵。②雌鼠經(jīng)過交配,受精卵從輸卵管中洗出。③立即對采集的受精卵進(jìn)行顯微注射。注射的轉(zhuǎn)移基因通常是線性結(jié)構(gòu),不采用原核生物的載體序列。整個過程看似簡單,但需要一系列實(shí)驗(yàn)步驟的配合，并且成功率最高也只有5％左右,所以必須對大量的卵進(jìn)行注射。例如,經(jīng)注射的卵有66％的成活率，成活的受精卵25%可正常發(fā)育，２5%的后代攜帶轉(zhuǎn)移基因，那么,注射1000個受精卵,才能獲得3０～５0個轉(zhuǎn)基因后代。并且，DNA在染色體上隨機(jī)整合,在某些個體中，轉(zhuǎn)移基因由于整合位點(diǎn)不當(dāng)而不能表達(dá)，在某些個體中因拷貝數(shù)高而過度表達(dá)，這會干擾動物的正常生理活動。3．胚胎干細(xì)胞法小鼠胚胎發(fā)育卵泡階段的細(xì)胞在培養(yǎng)基中依然保持分化能力.當(dāng)把它們重新輸回胚胎胚泡后，仍保留著分化成其他細(xì)胞(包括生殖細(xì)胞）的能力，這類細(xì)胞稱多能性胚胎干細(xì)胞（ESｃeｌl)。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可承受轉(zhuǎn)基因操作而不影響其分化的多能性.外源基因通過同源重組可特異性整合在ＥS基因組內(nèi)的一個非必需位點(diǎn)上,構(gòu)成工程化胚胎干細(xì)胞。經(jīng)體外篩選鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)后再輸回小鼠胚胎胚泡中，最終形成轉(zhuǎn)基因動物（圖3—32).這種方法避免了前兩種方法帶來的整合隨機(jī)性。圖3—３2胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化法(引自G1icｋ&Pasｔernaｋ,１9９8）（二）轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物具有廣闊的應(yīng)用前景,目前主要應(yīng)用于以下幾個方面:①利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的表達(dá)與功能。②利用轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞生產(chǎn)生物大分子。③利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行動物遺傳性狀改良的研究.④基因治療.１。乳腺生物反應(yīng)器由于基因工程技術(shù)的出現(xiàn),人類已可以大量取得過去只能從組織中提取的珍稀蛋白，用于研究或治療疾病。可以完成這件工作的系統(tǒng)有細(xì)菌發(fā)酵、真核細(xì)胞培養(yǎng)和乳腺生物反應(yīng)器等3種主要生產(chǎn)方式。在這３種生產(chǎn)方式中，乳腺生物反應(yīng)器有特殊優(yōu)點(diǎn)。乳腺生物反應(yīng)器是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)中蛋白質(zhì)合成與分選的機(jī)制，結(jié)合基因工程技術(shù)、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，利用動物的乳腺分泌某些具有重要價值的基因產(chǎn)物(圖3-33)。圖3—33用轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白質(zhì)（引自Wａｓtonetaｌ，l９9４)乳腺生物反應(yīng)器是一項(xiàng)綜合技術(shù)，發(fā)展乳腺生物反應(yīng)器不僅需要基因工程技術(shù)，還需要動物胚胎技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、蛋白質(zhì)提純技術(shù)和常規(guī)畜牧技術(shù)。到目前為止，世界各國科學(xué)家已經(jīng)制造出乳腺分泌各種醫(yī)用蛋白質(zhì)的牛、山羊、綿羊、豬和家兔，乳腺分泌的蛋白質(zhì)達(dá)到可商業(yè)開發(fā)水平的轉(zhuǎn)基因動物達(dá)十多種。２．轉(zhuǎn)基因鼠在揭示人類分子病病理中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠可作為研究人類疾病的模式系統(tǒng),或?qū)δ撤N可能的藥物進(jìn)行檢測.完整的動物模式應(yīng)模擬人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，但是,小鼠畢竟不是人類,所以，從轉(zhuǎn)基因模型得到的信息在醫(yī)學(xué)上并不總具有相關(guān)性，不過,在研究復(fù)雜疾病時，可對致病原因的發(fā)現(xiàn)帶來突破性進(jìn)展.現(xiàn)已發(fā)展了多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型用來研究人類遺傳疾病,例如阿爾茨海默病(Aｌzhaeｉrｎeｒdｉｓｅａse）、關(guān)節(jié)炎(ａrthrｉtｉｓ）、肌肉萎縮癥（musｃｕlarｄdystropｈy）、腫瘤發(fā)生（ｔumorｉgｅneｓiｓ)、高血壓（ｈｙpｅｒtension)、神經(jīng)退行性病變失調(diào)(neurodegeｎｅrativediｓorder）、內(nèi)分泌功能異常（endｏcrｉnｏlogｉcaｌdysfuｎctiｏ