第4篇遺傳與變異123.1基因工程的相關(guān)技術(shù)23.2基因工程主要的工具酶23.3基因克隆的質(zhì)粒載體23.4重組DNA的基本步驟23.5基因工程的應(yīng)用21重組DNA技術(shù)232重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）：是指將一種生物體的某個特定基因（即目的基因，其本質(zhì)是通過分離純化或人工合成的DNA分子）與載體DNA在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（宿主細胞）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的一系列操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)、遺傳工程、基因工程。3核酸的分子雜交DNA的變性與復(fù)性變性：雙鏈分開（堿基間氫鍵斷裂）加熱、極端pH、有機溶劑、低鹽濃度復(fù)性：雙鏈重新締合退火（緩慢降溫），或其它環(huán)境條件復(fù)原雜交：不同來源的兩條互補核酸序列締合成雙鏈5分子探針探針(probe)：是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。核酸探針：是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。核酸探針分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。6放射性標記物常用的同位素有32P、3H、35S非放射性標記物應(yīng)用較多的是生物素和地高辛。二者對親和素有獨特的親和力，通過連接在親和素上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進行檢測。探針標記物7核酸印跡Southern印跡:Southernblot,可以檢測特定的DNA序列。先用限制性內(nèi)切酶對DNA樣品進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對位置保持不變。用探針與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，洗脫，曝光。810Northern印跡:Northernblot,是用來分析RNA的。Northern印跡的方法與Southern印跡基本相同，可參照進行。斑點印跡：Dot-blot，將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。但不能鑒定所測基因的分子量。原位雜交：將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。用來檢測完整細胞中的核酸序列。12PCR的基本步驟：變性、退火、延伸三步反應(yīng)：高溫變性：95oC雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA。低溫退火：約55oC引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位配對結(jié)合。適溫延伸：72oC以目的基因為模板，從引物的3’端延伸，合成互補的新DNA鏈。每一輪聚合酶鏈式反應(yīng)可使目的基因片段增加一倍，30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個基因片段。14TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的熱變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；15TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；16TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。17TargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。18No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2023.2基因工程主要的工具酶限制性內(nèi)切酶

DNA連接酶反轉(zhuǎn)錄酶21粘性末端平頭末端。粘性末端23DNA連接酶不同來源的DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，由DNA連接酶連接封閉。在一條DNA鏈的3′末端具有一個游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5′-末端具有一個磷酸基團（-P）的情況下，DNA連接酶能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA上的nick（切口），而不能封閉gap（缺口）。24

DNA連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶:只能連接平齊末端，用NAD+作能源輔助因子噬菌體T4DNA連接酶:能連接平齊末端和粘性末端，用ATP作能源輔助因子。26T4連接酶27平齊末端DNA片段的連接：添加接頭→粘性末端添加poly(dA)、poly(dT)

尾部→粘性末端2830反轉(zhuǎn)錄酶又稱RNA指導的DNA聚合酶。是以RNA為模板合成DNA的酶。這種酶是1970年美國科學家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別于動物致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的，他們并因此獲得1975年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。主要用途是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶3123.3基因克隆的質(zhì)粒載體32質(zhì)粒：是細菌細胞中獨立于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。進入到宿主細胞中的一個質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù)。質(zhì)粒33載體：是一種可以將外源DNA片段送入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具，這種工具也是一個DNA分子?？寺≥d體：在載體上插入合適大小的外源DNA片段，并引入到宿主細胞中進行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量擴增。表達載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），使外源DNA片段能夠在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)。目前最常用的載體包括細菌質(zhì)粒、l噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。34質(zhì)粒做為克隆載體的必備條件：具有復(fù)制起點；攜帶選擇標記；具有多種限制酶切位點；具有較小分子量和較高拷貝數(shù)；具有安全性。35質(zhì)粒載體pBR322是研究得最多，使用最早且應(yīng)用最廣泛的大腸桿菌質(zhì)粒載體之一。符號質(zhì)粒載體pBR322中的“p代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實驗編號。質(zhì)粒載體pBR32236優(yōu)點一：相對分子質(zhì)量較小。質(zhì)粒載體pBR322的大小為4361bp,優(yōu)點二：它帶有一個復(fù)制起始位點，保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細胞中行使復(fù)制的功能。優(yōu)點三：具有兩種抗生素抗性基因，可供轉(zhuǎn)化子的選擇標記。優(yōu)點四：具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增以后，每個細胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。37FeaturesofplasmidpBR32238Restrictionmap391．該質(zhì)粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。2．進入宿主細菌細胞后，pUC18在每個細胞中可復(fù)制形成大約500個拷貝。3．在pUC18中有一小段人為設(shè)計和插入的具有多種限制性酶切位點的序列，即多克隆位點細菌質(zhì)粒pUC184023.4重組DNA的基本步驟41重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞，并能在受體細胞中復(fù)制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。42獲得目的基因常用的方法：直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(genelibrary)，從中調(diào)用目的基因；以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段；利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段；人工合成DNA。43酶切連接轉(zhuǎn)化擴增檢測目的基因的獲取克隆載體的構(gòu)建外源基因與載體的連接（體外重組）重組DNA導入受體菌轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定克隆基因的表達44以大腸桿菌為宿主菌進行基因的克隆4523.5基因工程的應(yīng)用461986年美國把煙草花葉病毒的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)移到番茄體內(nèi)，它們可對致命的病毒產(chǎn)生抗性，培育出抗煙草花葉病毒的番茄植株?？共《局仓辏?7將蘇云金桿菌的殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入植物細胞后，當害蟲在這種轉(zhuǎn)基因植株上取食后會使其致命。

例如：將殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花后已獲得了抗蟲棉花。據(jù)估計，棉花殺蟲劑每年耗資6．45億美元，抗蟲棉花的育成將對減少殺蟲劑的用量、保護環(huán)境有巨大的作用。這是全球第一個被批準商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物?？瓜x害植株：48將一種蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆植株，大豆即獲得有抗阿特拉津除草劑的能力。

抗除草劑植株：49抗鹽堿、抗干旱、抗凍害、抗環(huán)境污染等抗逆性基因的轉(zhuǎn)化。抗環(huán)境因子的植株：轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒50改良品質(zhì)的植株：轉(zhuǎn)基因生菜含鐵量高美國新型轉(zhuǎn)基因巨型大南瓜51真正的轉(zhuǎn)基因藍玫瑰，不是用染料染上去的（日本）提高其經(jīng)濟價值或觀賞價值Transgenicpetunia(withextra‘purple’gene)矮牽牛52轉(zhuǎn)珊瑚蟲紅色基因的斑馬魚水母熒光蛋白基因5354把大鼠生長因子基因轉(zhuǎn)入小鼠得到巨大型的轉(zhuǎn)基因小鼠。55乙肝疫苗原先必須以乙肝患者的血液作原料，通過精細提取，才能取得?？茖W家們將乙肝病毒基因中生產(chǎn)抗原的部分切割下來，然后跟其他質(zhì)粒進行重組，再引入到大腸桿菌DNA的合適位置上。通過培養(yǎng)，大腸桿菌十分順利地產(chǎn)生了人們所需要的乙肝疫苗。利用基因工程菌生產(chǎn)藥物56生長激素是一種由腦垂體分泌的微量的化學物質(zhì)。幼年時生長激素分泌過少引起侏儒癥。過去，人們常用尸體上切下的腦垂體提取生長激素，因而產(chǎn)量很低?，F(xiàn)在，將人生長素基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，可生產(chǎn)人生長激素。每升菌液可得到人生長激素2.4毫克。發(fā)酵罐的容量可達700升。57這種萵苣制得的胰島素也必須制成粉末狀，裝入膠囊后才能使用，因為服用劑量必須仔細加以控制。纖維素組成的植物細胞壁可以在口服后的初始階段防止胰島素被降解。當含有胰島素的植物細胞到達腸壁后，腸居細菌開始將植物細胞壁緩慢分解，胰島素隨之被逐漸地釋放到血液中。利用轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物因為種植萵苣的成本很低，美國佛羅里達大學丹尼爾研究小組通過基因工程技術(shù)將胰島素基因移植到萵苣中。58利用轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物2007年阿根廷科學家已將參與人體胰島素分泌的基因植入了這些牛犢的基因組中，這樣，科學家就能在產(chǎn)出的牛奶中提取人體胰島素，用于治療糖尿病。這項轉(zhuǎn)基因技術(shù)將提高胰島素的生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本。59環(huán)境保護基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。工程菌處理印染廢水工程菌處理含油廢水耐鹽工程菌處理含鹽工業(yè)廢水環(huán)保水處理潔凈劑（工程菌）60噴灑工程菌清除石油污染61

優(yōu)點：1.解決糧食短缺問題2.減少農(nóng)藥使用，避免環(huán)境污染。3.節(jié)省生產(chǎn)成本，降低食物售價。4.增加食物營養(yǎng)，提高附加價值。5.增加食物種類，提升食物品質(zhì)。6.促進生產(chǎn)效率，帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展?；蚬こ痰娘L險62

風險：

（1）除草劑使用的增加：科學家估計，基因化的農(nóng)作物對除草劑具有抵抗力，實際應(yīng)藥量高于正常的3倍。農(nóng)民知道其作物對除草劑有抵抗力，會大量使用除草劑。（2）有報導，將優(yōu)良的特定的基因（如抗殺蟲劑）植入作物，可能會使周圍野生植物雜草一并獲得改良，呈現(xiàn)出抗殺蟲劑的特征。（3）生態(tài)被破壞：通過食物鏈影響當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，新的微生物與有親緣關(guān)系的生物進行有效的竟爭，若干年后，可能對地壤、野生近緣種、普通作物、相鄰的植物及環(huán)境造成破壞。（4）轉(zhuǎn)基因生物除對害蟲和病菌致毒外，對有益生物也將產(chǎn)生直接或間接的影響和危害。如果大規(guī)模的種植轉(zhuǎn)基因作物，可能會減少有益昆蟲的種群。63(6)可使動物、植物、微生物甚至人的基因相互轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因動物若逃逸到環(huán)境中，會通過改變物種間的競爭關(guān)系，破壞原有自然生態(tài)平衡；轉(zhuǎn)基因微生物與其他生物交換遺傳物質(zhì)，可能產(chǎn)生新的有害生物或增強有害生物的危害性，甚至引起疾病的流行。(7)威脅人體健康。轉(zhuǎn)基因活生物體及其產(chǎn)品作為食品進入市場，可能使人體產(chǎn)生某些毒理作用和過敏反應(yīng)。例如:轉(zhuǎn)基因生物體中使用的抗生素標記基因，如果進入人體，也可能使人體對很多抗生素產(chǎn)生抗性。國外已有兒童飲用轉(zhuǎn)基因大豆豆?jié){產(chǎn)生過敏反應(yīng)的報道。而這些影響往往在短期內(nèi)無法被監(jiān)測和確定，需要很長時間才能表現(xiàn)出來。64人類基因組2424.1人類基因組24.2人類基因組計劃6524.1人類基因組66基因組：是指一個物種的單倍體細胞中的全部DNA。核基因組：單倍體細胞核中染色體所含的DNA分子。線粒體基因組：線粒體所含的DNA分子。葉綠體基因組：葉綠體所含的DNA分子。病毒基因組：病毒粒中所含的DNA或RNA分子。什么是基因組？67基因組學：是研究生物體的基因和基因組的結(jié)構(gòu)組成、不穩(wěn)定性和功能的一門學問。結(jié)構(gòu)基因組學：研究基因和基因組的結(jié)構(gòu)，包括基因定位、基因組作圖、DNA測序等。功能基因組學：是對基因組功能進行注釋。研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達及調(diào)控模式。

后基因組學：功能基因組學也被稱為后基因組學。什么是基因組學？68基因：是遺傳的基本單位，是位于染色體上的一段DNA片段，它編碼蛋白質(zhì)、RNA或rRNA分子，或無編碼功能，僅對上述編碼序列起調(diào)節(jié)作用。什么是基因？69根據(jù)是否具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，基因可分為三類:一類是既具有轉(zhuǎn)錄功能又具有翻譯功能的基因，這類基因是指編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)基因以及編碼阻遏蛋白的調(diào)節(jié)基因;第二類是只具備轉(zhuǎn)錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括編碼tRNA和編碼rRNA的基因;第三類是既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯的基因，這類基因?qū)虮磉_起調(diào)節(jié)和控制的作用，包括啟動基因和操縱基因(有時統(tǒng)稱為控制基因)。70原核細胞的基因結(jié)構(gòu)71真核細胞的基因結(jié)構(gòu)72人類基因組總長約3.2×109

bp，大約含3-4萬個基因。人類的基因只占全部DNA的10%?；蛲釪NA占全部DNA的90%。包括各種類型的重復(fù)序列，如：衛(wèi)星DNA，小衛(wèi)星DNA，微衛(wèi)星DNA等。人類基因組的組成737424.2人類基因組計劃75人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)由美國科學家于1985年率先提出、1990年正式實施、計劃歷時15年，旨在闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認識自我。什么是人類基因組計劃？76人類基因組計劃是一項偉大的科學計劃，與阿波羅登月計劃、曼哈頓原子彈計劃同稱為人類自然科學史上的三大計劃。77人類基因組計劃的參與國家美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日本和中國。作為參與這一計劃的唯一發(fā)展中國家，我國于１９９９年躋身人類基因組計劃，承擔了１％的測序任