淀粉酶活性的測定一、目的要求了解果蔬組織中淀粉酶的特點(diǎn)，學(xué)習(xí)淀粉酶活性的測定原理和方法。二、基本原理果蔬組織中的淀粉可在淀粉酶作用下轉(zhuǎn)化形成還原糖。淀粉酶對(duì)淀粉的分解作用是生物體利用淀粉進(jìn)行碳水化合物代謝的初級(jí)反應(yīng)。淀粉酶（Amylase）包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子淀粉酶活性最強(qiáng)。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。重要的淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。其中，α-淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，即作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖、麥芽三糖、寡聚葡萄糖、α-極限糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。α-淀粉酶比較耐熱但不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。Ca2+卻能使α-淀粉酶活化和穩(wěn)定。β-淀粉酶從淀粉的非還原端作用于α-1,4-糖苷鍵，每次切下一分子麥芽糖，遇到支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵時(shí)停止，生成β-極限糊精。β-淀粉酶又被稱為糖化酶，它是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl-等輔助因子。與α-淀粉酶相反，β-淀粉酶不耐熱但卻耐酸，在70℃保溫15min可使其鈍化。根據(jù)它們的這種特性，鈍化其中之一，就可測出另一個(gè)的活性。葡萄糖淀粉酶則從淀粉的非還原端每次切下一個(gè)葡萄糖。淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活性的大小與生成的還原糖的量成正比。因此，可以用麥芽糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉水解生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活性。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同時(shí)存在。本實(shí)驗(yàn)中先測定（α+β）淀粉酶總活性，然后在70℃加熱15min，鈍化β-淀粉酶，測出α-淀粉酶活性。再與總活性（α+β）相比較，求出β-淀粉酶的活性。三、材料、儀器及試劑（一）材料馬鈴薯、香蕉、芒果等。（二）儀器及用具電子天平、分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋（40℃、70℃、100℃）、具塞刻度試管（20mL）、移液器或刻度吸管、容量瓶、研缽、離心管、試管。（三）試劑1．標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/mL）精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。2．3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑（1）配制500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液；（2）配制262mL的2mol/LNaOH溶液；（3）稱取6.3g的3,5-二硝基水楊酸；（4）稱取5.0g結(jié)晶酚；（5）稱取5.0g亞硫酸鈉；（6）將（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，攪拌，使之溶解。待冷卻后，轉(zhuǎn)入到1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。3．100mmol/L、pH5.6的檸檬酸緩沖液母液A（200mmol/L檸檬酸）：稱取42.03gC6H8O7·H2O2，用蒸餾水溶解、定容至1000mL。母液B（200mmol/L檸檬酸鈉）：稱取58.82gNa3C6H5O7·2H2O2，用蒸餾水溶解、定容至1000mL。取27.5mL母液A與72.5mL母液B，混勻，調(diào)節(jié)pH至5.6，用蒸餾水稀釋至200mL，即為100mmol/L、pH5.6的檸檬酸緩沖液。4．1%淀粉溶液稱取1g可溶性淀粉溶于100mL100mmol/L、pH5.6的檸檬酸緩沖液中。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支具塞刻度試管，編號(hào)，按表13加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水至20mL。以0號(hào)管作為空白調(diào)零，在波長540nm處比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。表13.淀粉酶活性測定繪制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量項(xiàng)目管號(hào)0123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液/mL00.20.61.01.41.82.0蒸餾水/mL2.01.81.41.00.60.20DNS試劑/mL2.02.02.02.02.02.02.0相當(dāng)于麥芽糖量/mg00.20.61.01.41.82.0（二）酶液制備稱取10.0g果蔬組織樣品，置于研缽中，加10mL蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，混合，在室溫（20℃）下放置提取20min，每隔數(shù)分鐘搖動(dòng)一次。然后于8000rpm離心20min，收集上清液，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶提取液，用于α-淀粉酶活性和淀粉酶總活性的測定。（三）活性測定取6支具塞刻度試管，編號(hào)，按表14進(jìn)行操作。表14.淀粉酶活性測定過程操作項(xiàng)目α-淀粉酶活性淀粉酶總活性（α+β）I-1I-2I-3II-1II-2II-3淀粉酶提取液/mL1.01.01.0鈍化β-淀粉酶在70℃水浴中保溫15min后，取出后在流水中冷卻淀粉酶提取液/mL1.01.01.0DNS試劑/mL2.0002.000預(yù)保溫將各試管和淀粉溶液置于40℃恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液(40℃)/mL1.01.01.01.01.01.0保溫40℃水浴中準(zhǔn)確保溫反應(yīng)5minDNS試劑/mL02.02.002.02.0加入DNS試劑后，搖勻各試管，置沸水浴中煮沸5min，取出后迅速冷卻，加蒸餾水至20mL，搖勻。按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法，在540nm波長下比色，記錄測定結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)540nm吸光度值（I組或II組）從標(biāo)曲查得麥芽糖量C(mg)樣品中淀粉酶活性(mg·min-1·g-1FW)123計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計(jì)算結(jié)果用I-2、I-3吸光度平均值與I-1吸光度值之差，II-2、II-3吸光度平均值與II-1吸光度值之差，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖量（mg），計(jì)算α-淀粉酶的活性和淀粉酶總活性，然后再計(jì)算出β-淀粉酶活性。淀粉酶活性以每分鐘每克鮮重果蔬樣品中酶催化作用下產(chǎn)生麥芽糖毫克數(shù)表示，即mg·min-1·g-1FW。 β-淀粉酶活性(mg·min-1·g-1FW)=淀粉酶總活性－α-淀粉酶活性式中：Cα——查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量，mg；CT——查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量，mg；V——淀粉酶提取液體積(α-淀粉酶為50mL)，mL；VⅠ——測定α-淀粉酶時(shí)吸取酶提取液的體積，mL；VⅡ——測定總（α+β）淀粉酶時(shí)吸取酶提取液的體積，mL；t——酶作用反應(yīng)時(shí)間，min；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)1．測定淀粉酶總活性時(shí)有時(shí)需要稀釋。樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。2．DNS試劑是強(qiáng)堿性試劑，在淀粉原酶液和稀釋液中分別先加入DNS試劑（I-1、II-1號(hào)試管），可以鈍化酶活性，作為空白對(duì)照。3．為了確保酶促反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí)，可以將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒溫水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，到達(dá)5min時(shí)取出試管，