電話(huà)：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)貨號(hào)：UPLC-MS-4579規(guī)格：25T/24S、50T/48S

紫外分光光度法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱(chēng)/規(guī)格25T50T保存條件提取液液體40mL×1瓶液體75mL×1瓶4℃保存試劑一液體25mL×1瓶液體40mL×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1瓶粉劑×1瓶4℃保存試劑三粉劑×1支粉劑×1支-20℃保存試劑四粉劑×1瓶粉劑×2瓶-20℃保存25T溶液的配制：1、試劑二：臨用前加入2mL丙酮；2、試劑三：溶于1mL丙酮，可分裝后-20℃保存。臨用前再用丙酮100倍稀釋后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配；3、試劑四：臨用前加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用；4、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1:1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。50T溶液的配制：1、試劑二：臨用前加入3mL丙酮；2、試劑三：溶于1mL丙酮，可分裝后-20℃保存。臨用前再用丙酮100倍稀釋后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配；3、試劑四：臨用前加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用；4、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1:1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。產(chǎn)品說(shuō)明：復(fù)合體Ⅰ（EC）H-CoQH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)NADHCoQO2還原O2-而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD+，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：1mL/操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）0.1g5001.0mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。4℃600g10min。將上清液移至另一離心管中，411000g15min。上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線(xiàn)粒體提取效果）。400μL（20%51015次Ⅰ活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。二、測(cè)定步驟紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。試劑一37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）預(yù)熱15min。操作表（在1mL石英比色皿中分別加入）試劑名稱(chēng)（μL）測(cè)定管樣本50試劑一770工作液100試劑四8010s的吸光值37℃（哺乳動(dòng)物或25℃（其它物種水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2擦干，記錄2min時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。三、復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體Ⅰ活力（U/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1608×ΔA÷CprV摩爾消光系數(shù)，6.22×1031mol=109nmol。注意事項(xiàng)：1-2（1.5ΔA0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣本體積來(lái)提高靈敏度。樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（1mg/mL，所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。50管反應(yīng)。附：使用樣本質(zhì)量計(jì)算公式：（50T/24S）A、上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。I活性（U/g質(zhì)量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1608×ΔA1÷WΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；W：樣本重量，g；109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。B、沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。I活性（U/g質(zhì)量）=[ΔA2×V反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣本)÷T=643×ΔA2÷WΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。撼恋碇貞殷w積，0.4mL；V樣：加入樣本體