葉綠體色素的提取、分離和理化性質(zhì)Ⅰ.提取與分離一、原理葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。這兩類色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動相）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后，可將各種色素分開。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料菠菜、小白菜葉片。（二）儀器設(shè)備研體，漏斗，三角瓶，剪刀，滴管，培養(yǎng)皿（直徑11cm），康維皿或平底短玻管，圓形濾紙（直徑11cm）。試劑（1）95%乙醇。（2）石英砂。（3）碳酸鈣粉。（4）推動劑：按石油醚：丙酮：苯（10：2：1）比例配制（V/V）。三、實驗步驟1.葉綠體色素的提?。?）取菠菜或其他植物新鮮葉片4～5片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入研缽中。（2）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加2~3ml.95%乙醇，研磨至糊狀，再加10~15mL95%乙醇，離心35min，提取上清液過濾于三角瓶中，殘渣用10mL95%乙醇沖洗.一同過濾于三角瓶中。（3）如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜葉最好），先用105℃殺青，再在80℃下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時稱葉粉2g放入小燒杯中，加95%乙醇20~30mL浸提，并隨時攪動。待乙醇呈深綠色時，濾出浸提液備用。2.葉綠體色素的分離（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm），另取一張濾紙條（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇葉綠體色素提取液，沿紙條的長度方向涂在紙條的一邊，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，風(fēng)干后，再重復(fù)操作數(shù)次，然后沿長度方向卷成紙捻，使浸過葉綠體色素溶液的一側(cè)恰在紙捻的一端。（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿突出）。（3）在培養(yǎng)皿內(nèi)放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿（圖2-11-1）。此時，推動劑借毛細管引力順紙捻擴散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。如無康維皿，也可在培養(yǎng)皿中放入一平底短玻管或塑料藥瓶蓋，以盛裝推動劑。所用培養(yǎng)皿底、蓋的直徑應(yīng)相同，且應(yīng)略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。當(dāng)推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風(fēng)干，即可看到分離的各種色素：葉綠素a為藍綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為鮮黃色，胡蘿卜素為橙黃色，用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。Ⅱ.理化性質(zhì)一、原理葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H'所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素、銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。皂化反應(yīng)式如下：二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料菠菜葉片。（二）儀器設(shè)備刻度試管，小試管，試管架，分光鏡，石棉網(wǎng)，燒杯，酒精燈，玻棒，鐵三角架，刻度吸量管，火柴。試劑（1）95%乙醇。（2）苯。（3）醋酸銅粉末。（4）5%的稀鹽酸。（5）醋酸-醋酸銅溶液：用50%的醋酸100mL溶人醋酸銅6g，再加蒸餾水4倍稀釋而成。（6）KOH-甲醇溶液：20gKOH溶入100mL甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的試劑中。三、實驗步驟本實驗第一項中提取的葉綠體色素乙醇溶液和水研磨勻漿，進行以下實驗：1.光對葉綠素的破壞作用（1）取4支小試管，其中兩支各加入5mL用水研磨的葉片勻漿，另外兩支各加入2.5mL葉綠體色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀釋1倍。（2）取1支裝有葉綠體色素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片勻漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對比觀察顏色有何變化，解釋其原因。（3）另取本實驗中用圓形濾紙層析分離成的色譜一張，通過圓心裁成兩半，一半放在直射日光下，另一半放在暗中，半小時后比較兩張色譜上的四種色素的顏色各有何變化。2.熒光現(xiàn)象的觀察。取1支20mL刻度試管加入5mL濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同？解釋原因。3.皂化作用（綠色素與黃色素的分離）（1）在做過熒光現(xiàn)象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入1.5mL20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻。（2）片刻后，加入5mL苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1~1.5mL蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），于試管架上靜置分層。若溶液不分層、則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動，直到溶液開始分層時，靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素），上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。4.吸收光譜的觀察將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對準(zhǔn)進光孔，看光譜有何變化，然后再將上層黃色素溶液對準(zhǔn)進光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結(jié)果用簡單的圖表示出來。5.H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代作用（1）取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液5mL，再加入5%HCl數(shù)滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。（2）當(dāng)溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。（3）另取醋酸-醋酸銅溶液20mL，置于燒杯中。取新鮮植物葉兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因。【注