實(shí)驗(yàn)二食品中大腸菌群的檢驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解大腸菌群在食品檢驗(yàn)中的意義。2.掌握檢驗(yàn)的程序和步驟。3.通過MPN檢索表的檢索得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、基本原理大腸菌群系指一群在32～37℃下24hr內(nèi)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)，來評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。食品中大腸桿菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）來表示，據(jù)此含義，所有食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的大腸菌群數(shù)均應(yīng)為100mL（g）食品內(nèi)允許含有大腸菌群的實(shí)際數(shù)值，為報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。一、牛天貴主編《食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》實(shí)驗(yàn)十二大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵分離培養(yǎng)復(fù)發(fā)酵（證實(shí)試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)操作步驟：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。

根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。

實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基及作用乳糖膽鹽發(fā)酵管（初發(fā)酵）伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)）乳糖發(fā)酵管（復(fù)發(fā)酵）1、乳糖膽鹽發(fā)酵管成分：蛋白胨20g、豬膽鹽5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸餾水1000mL，pH值7.4制法：略實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：如圖現(xiàn)象及原理大腸桿菌：菌落深紫色，且有綠色金屬光澤；產(chǎn)酸能力較弱的幾種腸道菌：也有相應(yīng)的棕色；不發(fā)酵乳糖的腸道菌：菌落是無色透明的，比如變形菌屬，沙門氏菌屬2、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）實(shí)驗(yàn)操作步驟：1）檢樣稀釋（無菌操作）①將25mL（或g）檢樣置于含225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用8000－10000r/min的速度處理1min）制成1：10的均勻稀釋液。②用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，混勻，制成1：100的稀釋液。③另取1mL滅菌吸管，按②操作依次做10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1mL滅菌吸管。3）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)接在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置（36士1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。4）證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1一2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置（36士1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24士2)h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽袍桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上進(jìn)行劃線取有核心和帶金屬光澤的深紫色菌落進(jìn)行革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養(yǎng)液鏡檢（革蘭氏陰性菌）37℃培養(yǎng)48h證實(shí)產(chǎn)氣（陽性）結(jié)果與否37℃培養(yǎng)24h37℃培養(yǎng)24h

實(shí)驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（或g）大腸菌群的MPN。結(jié)果表示方法：120MPN/100mL（g）附表：大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）檢索表注：①本表采用3個(gè)稀釋度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01mL(g)。每稀釋度3管。②表內(nèi)所列檢樣量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.1ML(g),0.01ML(g）和0.001mL(g）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余可類推。50ml管陽性數(shù)10ml管陽性數(shù)1ml管陽性數(shù)每100ml的MPN000000110022010101120123020202130224030303150326100110131024103611031115112711391205121712210123121308表2-350毫升檢樣接種1管、10毫升、1毫升檢樣各接種3管的大腸桿菌最近似數(shù)檢索表相關(guān)視頻第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法

需要用到的培養(yǎng)基（1）LST肉湯培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸鈉0.1g，蒸餾水1000mL。制法：將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mm×150mm試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。抑菌劑的選擇大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。實(shí)驗(yàn)步驟及操作要點(diǎn)：1）無菌取樣并制作梯度稀釋液；2）樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。3）從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。4）初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。LST結(jié)果判斷大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管。5）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。6）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告按5）確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。表B.1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

需要用到的培養(yǎng)基（1）VRBA：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化鈉5.0g，膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g，中性紅0.03g，結(jié)晶紫0.002g，瓊脂15g～18g，蒸餾水1000mL，pH7.4±0.11）樣品的稀釋：如第一法2）平板計(jì)數(shù)選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。3）及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。實(shí)驗(yàn)步驟及操作要點(diǎn)：4）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU

之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。5）證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。6）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以4）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。

三大腸菌群PetrifilmTM測試紙片法四、美國FDA標(biāo)準(zhǔn)方法——行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用兩步法：用于對(duì)出口食品中大腸菌群進(jìn)行檢驗(yàn)

推測試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)