：學(xué)號(hào) 專業(yè)：08基礎(chǔ)醫(yī)實(shí)驗(yàn)成員：第5小組///實(shí)驗(yàn)日期細(xì)胞組DNA的及其濃度測(cè)本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)五所HL60細(xì)胞組DNA為模板，以c-myc上一329bpPCRPCRDNA補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延3DNA下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；DNA（復(fù)性模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板TaqDNA以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基下次循環(huán)的模板，使產(chǎn)物DNA的量按2的n槽，電泳儀，紫外觀察儀，200mlPCR器材：0.2ml，PCR（ABI樣槍及槍頭等。1)模板DNA：為HL60細(xì)胞組總22×EsMg2+、dNTPsPCR2x。預(yù)配好的PCR混合液使操作更加簡(jiǎn)單快捷，可最大限度地減少人為誤差和污染。獨(dú)創(chuàng)的MasterMix配方使整個(gè)反應(yīng)體系非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。含的2xEsTaqMasterMixPCR1（100μmol/L2（100μmol/L1×TAE：0.04mol/LTris-乙酸;0.001 Agarose1.2g60mLTAE2%mg/ml0.2mlPCR2×EsTaq10Primer10.5Primer2（10μ0.5Template（0.50.520PCR94℃6057℃退火30 30個(gè)循72℃3072℃5PCR105℃配制2％的Agarose凝膠稱取1.2gAgarose放入200mL三角燒瓶中，60mLTAE55℃時(shí)加入溴化乙啶溶液3μL，0.5μg/mL。澆板（用薄梳子，水平放置，待凝。10μLPCR8μLDNAMarkerⅠ作為都必須經(jīng)過(guò)高壓蒸汽；PCR注意加樣順序：ddH2O、2×mixDNA，DNAPCR中,Taq酶在92.5℃和97.5℃其保持時(shí)間分別為180min和5-6min。95℃35min，PCR95℃；本組（5組）marker300-400bp329kbPCR假，不出現(xiàn)擴(kuò)增條PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的②引物的質(zhì)量與特異性③酶質(zhì)量，④PCR模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白失或不夠而導(dǎo)致假需注意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴PCRODPCRMg2+濃度：Mg2+PCRPCR擴(kuò)增的特異性濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條PCR20μl、30μl、50μl定，在做小體積如20μl后，再做大體積時(shí)，一定要重新摸索條件，否則容易失極有可能出現(xiàn)假；退火溫度過(guò)低，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效PCRPCRPCRPCRPCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)物質(zhì)外所有試劑或器材均應(yīng)高壓所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)使用拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCRPCR性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)PCRPCR或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多dNTPMg2+本次實(shí)驗(yàn)中，本組結(jié)果出現(xiàn)了圖上所顯示的片狀條帶，我有以下推斷因組DNA，純度并不如人意，A260/A280=1.70<1.8; 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，MIXPCRPCRPCRPCRPCRPCR主要是樣品DNA交叉污染。提取DNA使用的儀器上殘留的雜質(zhì)DNA或反應(yīng)管中殘留的PCR產(chǎn)物、PCR操作