歡迎來(lái)主頁(yè)下載歡迎來(lái)主頁(yè)下載---精品文檔精品文檔精品文檔第十一章生物素-親和素放大技術(shù)是一種以生物素和親和素具有的多級(jí)放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標(biāo)記。第一節(jié)生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記bioti244.31k一、活化生物素利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素。（一）標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素（二）標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素有兩種：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。（三）標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素：3-（N-馬來(lái)酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。（四）探針。光敏生物素：用于DNA或RNADNABNHSBHZ：與核酸胞嘧啶分子中的N-4二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)（一）生物素化蛋白質(zhì)衍生物的特性生物素化蛋白質(zhì)衍生物有兩類，一種是生物素化的大分子活性物質(zhì)（如抗原、抗體），材料（如酶）結(jié)合生物素后制成的標(biāo)記物。（二）標(biāo)記方法時(shí)可與多個(gè)親和素分子結(jié)合。通常選用第二抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，制備的標(biāo)記物具有通用性。標(biāo)記酶：如生物素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶。（三）標(biāo)記注意事項(xiàng)（（性、中性或堿性），選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。分子數(shù)量控制在一定范圍，以免影響標(biāo)記物的活性。在生物素與被標(biāo)記物間加入交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)。第二節(jié)親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記親和素和鏈霉親和素是大分子蛋白，幾乎可以和任何用于標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合。一、親和素及其活性親和素4，二者之間的親和力極強(qiáng)。二、鏈霉親和素及其活性鏈霉親和素（SA）是由鏈霉菌streptomycesavidinii分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為65kD。鏈霉親和素（SA）分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，因此一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個(gè)生物素分子。三、親和素（或鏈霉親和素）的標(biāo)記用于標(biāo)記親和素或鏈霉親和素的小分子示蹤物有1酶、異硫氰酸熒光素（FITC）和膠體金。中的生物素結(jié)合，間接地與酶形成結(jié)合物。幾種制備親和素（或鏈霉親和素）與常用酶形成標(biāo)記結(jié)合物的方法：（一）親和素的標(biāo)記1.HRP改良過(guò)碘酸鈉法戊二醛法親和素-生物素化HRP復(fù)合物的制備（二）鏈霉親和素的標(biāo)記鏈霉親和素（SA）因表面所帶正電荷少，且不含糖基，在實(shí)驗(yàn)中的非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于親和素，因此目前以鏈霉親和素標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。HRP-SA-生物素化HRPAP-SA第三節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)生物素、親和素結(jié)合的多級(jí)放大作用，以及BAS既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使BASBAS一、靈敏度：每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，因此，BAS具有多級(jí)放大作用，使其在應(yīng)用時(shí)可極大地提高檢測(cè)方法的靈敏度。二、特異性：親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性。而且，BAS結(jié)合特性不會(huì)因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，使其在實(shí)際應(yīng)用中可最大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。三、穩(wěn)定性：性；而且酸、堿、變性劑等均不影響其結(jié)合。四、適用性：五、其他：BAS可依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)方法要求制成多種通用性試劑（如生物素化第二抗體等），適用于不同的反應(yīng)體系；而且都可高度稀釋，用量很少，實(shí)驗(yàn)成本低；尤其是BAS與成本高昂的抗原特異性第一抗體偶聯(lián)使用，可使后者的用量大幅度減少，節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。此外，由于生物素與親和素的結(jié)合具高速、高效的特性，盡管BAS的反應(yīng)層次較多，但所需的溫育時(shí)間不長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)往往只需數(shù)小時(shí)即可完成。第四節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親和素系統(tǒng)基本類型及原理（一）。（二）直接用標(biāo)記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的BA法，或稱標(biāo)記親和素-生物素法（LAB）。BAB法BAB是以游離的親和素（或鏈霉親和素）作為橋（如酶標(biāo)生物素連接起來(lái)，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)分子的目的。ABC法ABC法是在BAB（或鏈霉親和素）與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成可溶性的親和素（或鏈霉親和素SABC）。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）AB（或SAB）中未飽和的（或鏈霉親和素或BA法或LAB）法是以標(biāo)記親和素（或鏈霉親和素）檢測(cè)。二、生物素-親和素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用（一）將BASELISA偶聯(lián)可提高ELISA4記抗體，可減少反應(yīng)中的空間位阻。（二）生物素-親和素系統(tǒng)可作為均相酶免疫測(cè)定中高效的酶活性調(diào)變系統(tǒng)。三、生物素-親和素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用通常采用BA（或鏈霉親和素（或鏈霉親和素（BAB法（或鏈霉親和素抗體的夾心法。酶放大時(shí)間分辨熒光免疫分析（EATRFIA）則是在抗原與固相McAb和生物素化McAb反應(yīng)形成夾心復(fù)合物后，加入堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的SA（ALP-SA）繼續(xù)反應(yīng)，經(jīng)生物素和SA的高親和力結(jié)合，形成復(fù)合物：固相McAb-Ag-（McAb-生物素化）-（SA-ALP）ALP再作用底物生成產(chǎn)物5件下，可與Tb3-EDTA形成熒光壽命長(zhǎng)且產(chǎn)額高的三元復(fù)合物用于檢測(cè)。四、生物素-親和素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析（IRMA）檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法）。此外，BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B，F(xiàn)成分的分離。該法的優(yōu)點(diǎn)是克服了其他IRMA法需多次離心的