第十三章生物制品分析概論

第十三章生物制品分析概論1第一節(jié)概述藥物的三大類:第一節(jié)概述藥物的三大類:2一、生化藥物與基因工程藥物的定義生化藥物:一般系指以下三種途徑獲得的藥物：其一，從動(dòng)物、植物及微生物分離純化；其二、生物——化學(xué)半合成；其三，現(xiàn)代生物技術(shù)制取。該類藥物主要包括：生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物、大分子結(jié)構(gòu)修飾物等。例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、核苷酸和脂等。一、生化藥物與基因工程藥物的定義生化藥物:一般系指以下三3續(xù)定義基因工程藥物:在確定了對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上,分離、純化或人工合成控制該蛋白質(zhì)合成的基因，并利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中進(jìn)行繁殖或表達(dá)

，從而大規(guī)模生產(chǎn)出具有預(yù)防和治療疾病作用的藥用蛋白質(zhì)。續(xù)定義基因工程藥物:在確定了對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用4二、生化藥物與基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類二、生化藥物與基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類5種類（續(xù)）氨基酸及其衍生物類藥物1、單氨基酸例如：亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、色氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、蘇氨酸等等。2、氨基酸衍生物例如：N-乙酰上-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽、S—氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸等等。3、復(fù)合氨基酸注射液例如：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液。S代表氨基酸的種類。種類（續(xù)）氨基酸及其衍生物類藥物6種類（續(xù)）藥用活性多肽1、垂體多肽：例如：促胃液素(5肽)、催產(chǎn)素(9肽)等。2、消化道多肽：例如：胃泌素(14肽，17肽和34肽三種)3、下丘腦多肽：例：促甲狀腺素釋放激素(3肽)。4、腦多肽：例：新啡肽(25肽)，-內(nèi)啡肽(3l肽)等。5、激肽類：例：血管緊張肽I(10肽)、Ⅱ(8肽)、Ⅲ(7肽

)等活性肽。6、其它肽類：例：谷胱甘肽(3肽)、1胸腺素(28肽)。

種類（續(xù)）藥用活性多肽7種類（續(xù)）藥物蛋白質(zhì)1、蛋白激素類藥物：例如：胰島素、生長激素、催產(chǎn)素。2、天然蛋白質(zhì)類藥物：例如：血清白蛋白、干擾素。3、蛋白質(zhì)類藥物制劑：例如：明膠海綿、氧化聚明膠。種類（續(xù)）藥物蛋白質(zhì)8種類（續(xù)）酶與輔酶類藥物1、助消化酶類：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶類：例：溶菌酶、胰DNA酶、膠原蛋白酶。3、凝血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纖溶酶、尿激酶。4、抗腫瘤酶：例：L-天門冬酰胺酶、組氨酸酶、精氨酸酶。5、其它酶類：例：超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、DNA酶、青霉素酶。6、輔酶類藥物：輔酶對(duì)酶的催化反應(yīng)起著促進(jìn)作用。例：輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、輔酶Q10、黃素單核苷酸。種類（續(xù)）酶與輔酶類藥物9種類（續(xù)）多糖類藥物該類藥物來源廣泛，以黏多糖為主，其特點(diǎn)為：（1）、由糖苷鍵將單糖連接而成多糖。（2）、因單糖結(jié)構(gòu)糖苷鍵位置不同，使多糖種類繁多，藥理功能各異。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。例如：肝素、硫酸軟骨素A和C、刺參多糖、銀耳多糖、人胎盤脂多糖、殼聚多糖。種類（續(xù)）多糖類藥物例如：肝素、硫酸軟骨素A和C、刺參多糖、10種類（續(xù)）脂質(zhì)類藥物1、磷脂：如腦磷脂、卵磷脂。2、降血脂：如天然亞油酸、亞麻酸、多價(jià)不飽和脂肪酸（PUFA）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、PGI2。3、膽酸：如去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸。4、固醇：如膽固醇、麥角固醇、-谷固醇。5、卟啉：如血紅素、膽紅素、原卟啉。

種類（續(xù)）脂質(zhì)類藥物11種類（續(xù)）核酸及其降解物和衍生物類藥物1、核酸：例如，從小牛胸腺或魚精中提取的DNA可用于治療精神遲緩、虛弱和抗輻射。2、多聚核苷酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干擾素的誘導(dǎo)劑，用于抗病毒、抗腫瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物：例，ATP、cAMP、CDP-膽堿、AMP、肌苷等。也可將它們進(jìn)行化學(xué)修飾后用于治療腫瘤和病毒感染。治療腫瘤的如6-巰基嘌呤、2-脫氧核苷。抗病毒的如，環(huán)胞苷、

5-碘苷。

種類（續(xù)）核酸及其降解物和衍生物類藥物12（二）、基因工程類藥物的種類（二）、基因工程類藥物的種類13三、生化藥物與基因工程藥物的特點(diǎn)1、共同特點(diǎn)：

均來自生物體,是生物體的基本生化成分,具有生物活性或生理功能,對(duì)疾病具有針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小、易于人體吸收。2、分子量大且不是定值小部分藥物（如：氨基酸、輔酶）屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物，大部分為大分子的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等)，其分子量一般幾千至幾十萬。對(duì)大分子的生化藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。所以，生化藥物常需進(jìn)行分子量的測(cè)定。

三、生化藥物與基因工程藥物的特點(diǎn)1、共同特點(diǎn)：2、分子量大且14特點(diǎn)（續(xù)）3．結(jié)構(gòu)確證難由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用元素分析、紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實(shí)。

4、全過程質(zhì)量控制該類藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬等均較敏感，往往需要對(duì)原料藥、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品進(jìn)行全過程質(zhì)量控制，且要求比其它藥物更為嚴(yán)格。5．需檢查生物活性在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時(shí)，有時(shí)因工藝條件的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。因此，對(duì)這些生化藥物，除了用通常采用的理化法檢驗(yàn)外。尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實(shí)其生物活性。

特點(diǎn)（續(xù)）3．結(jié)構(gòu)確證難4、全過程質(zhì)量控制5．需檢查生物活性15特點(diǎn)（續(xù)）6．需做安全性檢查由于生化藥物的性質(zhì)特殊。生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)。故生化藥物常需做安全性檢查，如熱原檢查、過敏試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)等。

7．需做效價(jià)測(cè)定該類藥物多數(shù)可通過含量測(cè)定，以表明其主藥的含量。但對(duì)酶類藥物需進(jìn)行效價(jià)測(cè)定或酶活力測(cè)定，以表明其有效成分含量的高低。

特點(diǎn)（續(xù)）6．需做安全性檢查7．需做效價(jià)測(cè)定16第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法

一、鑒別試驗(yàn)

真?zhèn)舞b別方法

化學(xué)藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法生化藥物與基因工程藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法、生物學(xué)方法。且需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤M(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法一、鑒別試驗(yàn)真?zhèn)舞b17（一）、理化鑒別

1、化學(xué)鑒別法

利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。

例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶茵酶分子中的四個(gè)肽鍵上的氮原子能與銅離子(Cu2+)絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。（一）、理化鑒別1、化學(xué)鑒別法例如，溶菌酶的鑒別采用呈18理化鑒別(續(xù))

2、紫外分光光度法由于很多生物大分子均有共軛系統(tǒng),可產(chǎn)生特征可見紫外吸收，使較多藥物能夠用紫外分光光度法的特征吸收進(jìn)行鑒別。例如，0.0lmol/L的三磷酸腺苷二鈉的鹽酸水溶液在257nm的波長處有最大吸收。用A250nm/A260nm的值0.17-0.27進(jìn)行鑒別。理化鑒別(續(xù))2、紫外分光光度法例如，0.0lmol/L19理化鑒別(續(xù))

3、高效液相色譜法利用對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。例如，重組人生長激素的鑒別：1）供試品與對(duì)照品的主峰保留時(shí)間一致。2）供試品與對(duì)照品的肽圖譜保持一致性。理化鑒別(續(xù))3、高效液相色譜法例如，重組人生長激素的鑒20（二）、生化鑒別

1、酶法由于酶催化化學(xué)反應(yīng)的高度專一性，利用特定的酶僅能催化特定的化學(xué)反應(yīng)，可以有效地鑒別該藥物。

例如，尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原．而具有相同作用的

鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。（二）、生化鑒別1、酶法例如，尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解21生化鑒別(續(xù))

2、電泳法基于生物大分子分子量的較大差異和荷電的差異，在電泳法中具有不同的遷移距離，從而鑒別生化藥物。例如，肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場(chǎng)作用下，向正極方向移動(dòng)，與肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置應(yīng)對(duì)應(yīng)。生化鑒別(續(xù))2、電泳法例如，肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：22生化鑒別(續(xù))

3、樣品脫鹽后用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定基因工程藥物往往有多個(gè)等電點(diǎn)，利用等電點(diǎn)聚焦從而形成多個(gè)區(qū)帶，基于該區(qū)帶的一致性鑒別藥物。

（三）．生物鑒別法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例如，用家兔驚厥試驗(yàn)來鑒別胰島素，它是通過胰島素的降血糖作用進(jìn)行鑒別的。當(dāng)劑量過大，血糖降低至一定水平(約30％)，家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50％葡萄糖注射液，補(bǔ)充血糖、驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。生化鑒別(續(xù))3、樣品脫鹽后用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定（三）．23▲生物藥物鑒別應(yīng)該注意以下三點(diǎn)：

（1）藥物的取樣：由于生物藥物多數(shù)為大分子藥物，有的化學(xué)結(jié)構(gòu)不明確，有的分子量不是定值，使質(zhì)量控制較為困難。在大量的樣品中取少量供試品進(jìn)行分析，應(yīng)考慮取樣的科學(xué)性、真實(shí)性和代表性，其基本原則是均勻、合理。

（2）鑒別結(jié)果評(píng)價(jià)：由于生化藥物的復(fù)雜性和不確定性，通常鑒別不是由一項(xiàng)試驗(yàn)完成，而是采用一組試驗(yàn)項(xiàng)目綜合評(píng)價(jià)一種藥物。

（3）目前仍存在相當(dāng)一部分生化藥物沒有找到有效的鑒別方法?！锼幬镨b別應(yīng)該注意以下三點(diǎn)：（1）藥物的取樣：由于生24二、雜質(zhì)檢查

1、一般雜質(zhì)檢查生化藥物的一般雜質(zhì)檢查項(xiàng)目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘?jiān)?。其檢查的原理及方法與化學(xué)藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同。

二、雜質(zhì)檢查1、一般雜質(zhì)檢查25雜質(zhì)檢查（續(xù)）

2．特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。

例如，胰蛋白酶是從動(dòng)物胰中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過程中，易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，根據(jù)糜蛋白酶的特性可以選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。

雜質(zhì)檢查（續(xù)）2．特殊雜質(zhì)檢查例如，胰蛋白酶是從動(dòng)物胰中提26三、安全性檢查

（一）、熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

詳見第十二章藥物制劑分析（P302-303）

（二）、異常毒性試驗(yàn)

異常毒性試驗(yàn)是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。

三、安全性檢查（一）、熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（二）、異27安全性檢查（續(xù)）

中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是一個(gè)限度試驗(yàn)。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗(yàn)動(dòng)物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物急性中毒而死亡，則反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過了正常水平，因此，本試驗(yàn)又稱異常毒性檢查法。

試驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠。試驗(yàn)方法：尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服給藥法。

安全性檢查（續(xù)）中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是28安全性檢查（續(xù)）

例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如：取體重17—22g的健康小白鼠5只，分別由皮下注射每1ml中含玻璃酸酶10000單位的氯化鈉注射液0.25ml，48h內(nèi)不得發(fā)生皮下組織壞死或死亡．如有一只小白鼠發(fā)生組織壞死或死亡，應(yīng)按上述方法復(fù)試，全部小白鼠在48h內(nèi)不得有組織壞死或死亡現(xiàn)象。安全性檢查（續(xù)）例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如：取體重29安全性檢查（續(xù)）

(三)、過敏試驗(yàn)過敏試驗(yàn)是檢查異性蛋白的試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物：豚鼠。試驗(yàn)方法：皮膚過敏試驗(yàn)、腹腔注射試驗(yàn)。

原因：藥物中夾雜有異性蛋白，在臨床使用時(shí)易引起病人多種過敏反應(yīng)（如，皮膚紅斑、血壓下降、休克和死亡等）。因此，有可能存在異性蛋白的藥物、應(yīng)作過敏試驗(yàn)。

安全性檢查（續(xù)）(三)、過敏試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物：豚鼠。原因：藥物30安全性檢查（續(xù)）

例如，蛋白制劑細(xì)胞色素C在制備中可能摻入雜蛋白，中國藥典規(guī)定該溶液及注射液應(yīng)做過敏試驗(yàn)。方法：取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每lml中含細(xì)胞色素C7.5mg的溶液，作為致敏液與供試品溶液。另取體重為250—350g的健康豚鼠6只，連續(xù)3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml，2周后，再自股(耳)靜脈注射供試品溶液lml，注射后15min內(nèi)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。安全性檢查（續(xù)）例如，蛋白制劑細(xì)胞色素C在制備中可能摻入雜31安全性檢查（續(xù)）

(四)、降壓物質(zhì)檢查法

降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。試驗(yàn)動(dòng)物：貓(或狗)。試驗(yàn)方法：血壓法檢查藥物中所含的降壓物質(zhì)。

雜質(zhì)的來源:在用動(dòng)物臟器或組織為原料制備生化藥物的過程中，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨甚酸脫羧形成的組胺、酪胺等胺類物質(zhì)，均為這類雜質(zhì)的來源。安全性檢查（續(xù)）(四)、降壓物質(zhì)檢查法試驗(yàn)動(dòng)物：貓(或狗)32安全性檢查（續(xù)）

(五)、無菌試驗(yàn)

無菌試驗(yàn)是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查項(xiàng)目之一。原因:由于許多生化藥物是在無茵條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥均做無菌檢查。

安全性檢查（續(xù)）(五)、無菌試驗(yàn)原因:由于許多生化藥物是在33安全性檢查（續(xù)）

無菌試驗(yàn)的基本步驟a)、制備培養(yǎng)基：

為細(xì)菌生長、繁殖提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)——碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。b)、選擇對(duì)照用菌液：供對(duì)照試驗(yàn)用。c)、具體檢查：如接種、培養(yǎng)等操作。d)、結(jié)果判斷：得出陰性或陽性的結(jié)論。安全性檢查（續(xù)）無菌試驗(yàn)的基本步驟34安全性檢查（續(xù)）

(六)、基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查

可能雜質(zhì):殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)突變體、蛋白質(zhì)裂解物等。

主要污染物:微生物、熱原、病毒等。

主要檢查項(xiàng)目:

1）外源性DNA2）宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)3）細(xì)菌內(nèi)毒素4）其它有關(guān)雜質(zhì)安全性檢查（續(xù)）(六)、基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查35安全性檢查（續(xù)）

(七)、致突變?cè)囼?yàn)致突變?cè)囼?yàn)一般包括：微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、嚙齒動(dòng)物微核試驗(yàn)、微生物電極法的致突變?cè)囼?yàn)。(八)、生殖毒性試驗(yàn)生殖毒性試驗(yàn)一般包括：一般生殖毒性試驗(yàn)、致畸敏感期毒性試驗(yàn)、圍生期毒性試驗(yàn)。安全性檢查（續(xù)）(七)、致突變?cè)囼?yàn)(八)、生殖毒性試驗(yàn)36四、含量（效價(jià)）測(cè)定

含量表示方法：通常有以下兩種方法1）百分含量表示。適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。2）生物效價(jià)或酶活力單位表示。適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。

四、含量（效價(jià)）測(cè)定含量表示方法：通常有以下兩種方法37第三節(jié)常用定量分析方法與應(yīng)用定量分析方法生化藥物和基因工程藥物常用的定量分析方法包括以下四類：第三節(jié)常用定量分析方法與應(yīng)用定量分析方法38定量分析方法（續(xù)）3）生物檢定法：以藥物對(duì)生物體的作用效果為依據(jù)，從而測(cè)定效價(jià)或活性。定量分析方法（續(xù)）3）生物檢定法：以藥物對(duì)生物體的作用效果為39定量分析方法（續(xù)）定量分析方法（續(xù)）40一、理化分析法

（一）、化學(xué)分析法基本原理：

基于分析組分的化學(xué)、物理性質(zhì)，將其溶解、揮發(fā)或轉(zhuǎn)化為易于與體系分離的純物質(zhì)，再對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定，從而獲得所分析樣品中被測(cè)組分的含量。1、重量法一、理化分析法（一）、化學(xué)分析法基本原理：1、重量法41理化分析法（續(xù)）

常用方法：

理化分析法（續(xù)）常用方法：42理化分析法（續(xù)）

2、滴定法

▲常用方法：酸堿滴定法、氧化還原滴定法、絡(luò)合滴定法?！驹恚喝魳悠分斜粶y(cè)組分與標(biāo)準(zhǔn)滴定液能夠定量地、快速地發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且該反應(yīng)具有較強(qiáng)的選擇性和適當(dāng)?shù)慕K點(diǎn)指示方法，我們將可以利用該滴定反應(yīng)測(cè)定相應(yīng)的化學(xué)組分。

理化分析法（續(xù)）2、滴定法▲常用方法：▲基本原理43理化分析法（續(xù)）

(二)、電化學(xué)分析法

▲常用方法：離子選擇性電極分析法、化學(xué)生物傳感器分析法、極譜分析法、微電流電位法?！驹恚寒?dāng)表面涂有敏感物質(zhì)的電極與被測(cè)藥物接觸時(shí),將發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生具有一定特征的電信號(hào)。電化學(xué)分析將利用該電信號(hào)與藥物濃度成比例的關(guān)系進(jìn)行藥物定量分析。

理化分析法（續(xù)）(二)、電化學(xué)分析法▲常用方法：▲44理化分析法（續(xù)）

(三)、光譜分析法

1、比色法樣品中被測(cè)組分在可見紫外光區(qū)沒有明顯的特征吸收，但它能夠與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，生成在可見光區(qū)具有明顯特征吸收的有色物質(zhì)?；谠撎卣魑盏膹?qiáng)弱，從而定量測(cè)定樣品中的被測(cè)組分。

2、紫外分光光度法若樣品中被測(cè)組分或被測(cè)組分轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在紫外光區(qū)具有明顯的特征吸收，基于該吸收分析測(cè)定被測(cè)組分。理化分析法（續(xù)）(三)、光譜分析法1、比色法2、紫45理化分析法（續(xù)）

▲比色法與紫外分光光度法的比較：實(shí)際上，它們均是相同一類分析方法。通常比色法要進(jìn)行衍生化，產(chǎn)生在可見光區(qū)有明顯吸收的有色物質(zhì)，而紫外光譜法通常不需要衍生化，若衍生化，也只是產(chǎn)生在紫外光區(qū)有明顯吸收的物質(zhì)。

理化分析法（續(xù)）▲比色法與紫外分光光度法的比較：46理化分析法（續(xù)）

例如：粘多糖硫酸軟骨素的比色法測(cè)定、蛋白質(zhì)和糜蛋白酶的分光光度法測(cè)定理化分析法（續(xù)）例如：粘多糖硫酸軟骨素的比色法測(cè)定、蛋白質(zhì)47理化分析法（續(xù)）

3、熒光分光光度法具有共軛大環(huán)的分子均能產(chǎn)生特征熒光光譜，利用熒光強(qiáng)度與濃度的比例關(guān)系對(duì)生物大分子進(jìn)行定量分析。由于很多生物大分子均有熒光吸收，因此熒光分光光度法是該類物質(zhì)非常重要的一種定量分析方法。

理化分析法（續(xù)）3、熒光分光光度法48理化分析法（續(xù)）

(四)、色譜分析法

1、高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromato-graphyi.e.HPLC）在生化藥物分析中，常用的HPLC有三種：a）反相高效液相色譜（reversedphaseHPLCi.e.RP-HPLC）b)

高效離子交換色譜(HighPerformanceIonExchangeChromatographyi.e.HPIEC)c)高效凝膠過濾色譜(HighPerformanceGelFiltrationChromatographyi.e.HPGFC).理化分析法（續(xù)）(四)、色譜分析法1、高效液相色譜49理化分析法（續(xù)）

(1)、反相高效液相色譜（RP-HPLC）▲特點(diǎn)可以總結(jié)為以下5個(gè)方面:a）固定相：柱填料為C4、C8和C18烷基硅烷鍵合相。這些直鏈飽和烷烴是通過共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上。最常用的為C18烷基鍵合相，即ODS。b）流動(dòng)相:為極性二元或三元組合溶劑，常用的為甲醇—水，乙腈—水，或甲醇、乙腈分別與緩沖液構(gòu)成的多元組合溶劑。理化分析法（續(xù)）(1)、反相高效液相色譜（RP-HPLC）50理化分析法（續(xù)）

c）樣品中極性大的組分先洗脫出柱，極性小的組分后流出色譜柱。d）鍵合固定相不易被極性流動(dòng)相洗脫，同時(shí)，由于固定相的非極性和強(qiáng)的化學(xué)惰性，使樣品易于洗脫，保持了色譜柱的可逆性和長壽命。e)易于程序化改變流動(dòng)相的組分濃度，即梯度洗脫法，從而分析組分性質(zhì)相差較大的復(fù)雜體系。理化分析法（續(xù)）c）樣品中極性大的組分先洗脫出柱，極性小的51理化分析法（續(xù)）

示例：基因工程藥物生白能的含量測(cè)定

▲固定相：ODS—120T▲

流動(dòng)相：A液：三氟乙酸——水（0.1%）B液：三氟乙酸水溶液（1%）——乙腈（90：10）緩沖液:pH=7.0的磷酸緩沖液▲洗脫方式:梯度洗脫，其程序?yàn)椋?/p>

理化分析法（續(xù)）示例：基因工程藥物生白能的含量測(cè)定52理化分析法（續(xù)）

▲

定量方法：外標(biāo)法、其外標(biāo)物為對(duì)照品。tR=21.236min為主成分生白能；tR=13.639min為添加劑人血白蛋白。理化分析法（續(xù)）▲定量方法：外標(biāo)法、53理化分析法（續(xù)）

(2)、高效離子交換色譜（HPIEC）

▲基本原理離子交換色譜是以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)和可交換離子基團(tuán)，當(dāng)流動(dòng)相帶著已電離化的組分通過固定相時(shí)，組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，在流動(dòng)過程中不斷發(fā)生可逆交換，根據(jù)組分離子對(duì)樹脂親和力不同而得到分離。▲特點(diǎn)可以歸納為以下4個(gè)方面:a）可在所有的PH值范圍內(nèi)使用。對(duì)于廣泛選擇各種緩沖液洗脫體系更為有利。

理化分析法（續(xù)）(2)、高效離子交換色譜（HPIEC）▲54理化分析法（續(xù)）

b)填料的使用壽命長，易于可逆再生。有效防止了污染柱的性能下降或報(bào)廢。

c)很少有非特異性吸附，對(duì)于保持樣品生物活性較為有利?；诖嗽?，離子色譜廣泛應(yīng)用于分離或分析可離解的生物化合物，如氨基酸、多肽、核酸、核苷和各種堿基以及蛋白質(zhì)。

d)流動(dòng)相多為水溶液。在以水為流動(dòng)相的離子交換色譜中，組分的保留值和分離度主要通過控制流動(dòng)相的PH值和離子強(qiáng)度來調(diào)節(jié)。組分的分離是采用鹽濃度增大的梯度洗脫方法。理化分析法（續(xù)）b)填料的使用壽命長，易于可逆再生55理化分析法（續(xù)）

(3)、高效凝膠過濾色譜（HPGFC）

▲基本原理固定相為多孔性凝膠，流動(dòng)相為緩沖水溶液。被分離的樣品組分分子依據(jù)其大?。ɑ蚍肿恿浚┎煌瑵B入凝膠孔的深度不同，洗脫的難易程度也不同，從而按組分的分子大?。ɑ蚍肿恿浚┓植级蛛x測(cè)定。▲特點(diǎn)a）組分的保留時(shí)間分布由組分分子大小分布決定。體積越小的組分分子，滲入凝膠孔越深，洗脫越困難，因此，大分子優(yōu)先于小分子被洗脫。

理化分析法（續(xù)）(3)、高效凝膠過濾色譜（HPGFC）▲56理化分析法（續(xù)）

b）流動(dòng)相為固定比例的緩沖水溶液。有時(shí)加入少量的能與水互溶的有機(jī)改性劑或表面活性劑。c）活性蛋白質(zhì)可以回收。d）HPGFC廣泛應(yīng)用于生物藥物大分子的分子量分布測(cè)定。它是測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的一種重要方法。理化分析法（續(xù)）b）流動(dòng)相為固定比例的緩沖水溶液。有時(shí)57理化分析法（續(xù)）

2、灌注色譜（PerfusionChromatography）基本原理灌注色譜的分離介質(zhì)為高度交聯(lián)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子物質(zhì),它具有80~150nm的大擴(kuò)散孔和600~800nm的貫穿孔。流動(dòng)相流經(jīng)介質(zhì)時(shí)，存在兩種方式：一種，在淺表面的大擴(kuò)散孔中的擴(kuò)散作用，另一種為直接通過內(nèi)表面的貫穿孔而流動(dòng)。由于貫穿孔的大孔徑使后者為主要的分離方式。分子結(jié)構(gòu)和大小的不同使其與內(nèi)表面孔的相互作用存在差異，從而達(dá)到分離測(cè)定的目的。理化分析法（續(xù)）2、灌注色譜（PerfusionChro58理化分析法（續(xù)）

▲特點(diǎn)a）分離柱內(nèi)表面積大量增加,使柱容量增大、分辨率提高。b）流動(dòng)相流速的增加對(duì)柱效的影響極小,因此生物大分子可以實(shí)現(xiàn)快速分離純化與測(cè)定。c）由于柱效高、分離時(shí)間短和生物活性降低少，因此，灌注色譜主要用于基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化與分析。理化分析法（續(xù)）▲特點(diǎn)b）流動(dòng)相流速的增加對(duì)柱效59二、酶法

（1）分析原理是以酶催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定或?qū)ι晌餄舛鹊臏y(cè)定而檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)含量。

酶是具有專一性催化功能的蛋白質(zhì)。利用酶的特性測(cè)定藥物的含量，與其他分析方法相比有許多獨(dú)特的特點(diǎn)，具體體現(xiàn)在以下六個(gè)方面：

（2）測(cè)定方法具有很強(qiáng)的專一性，常用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類物質(zhì)的分析鑒定。二、酶法（1）分析原理是以酶催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，60酶法（續(xù)）

（3）樣品一般不需要很復(fù)雜的預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單。

（4）樣品和試劑用量少，測(cè)定快速準(zhǔn)確、靈敏度高。（5）反應(yīng)條件溫和，一般不需要強(qiáng)酸強(qiáng)堿。（6）酶不易于保存，結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，易于受外界條件的影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或變性而引起酶失活。▲在實(shí)際分析中，影響酶應(yīng)用的兩個(gè)最顯著的因素為“強(qiáng)的專屬性”和“不穩(wěn)定性”。酶法（續(xù)）（3）樣品一般不需要很復(fù)雜的預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單。61酶法（續(xù)）

（一）、酶活力測(cè)定法1、基本概念▲酶的活性單位(國際單位IU)在25℃下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適的pH值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位。酶的比活性即定為一毫克酶的活性單位。▲酶活力（酶活性）酶活力是指酶催化某化學(xué)反應(yīng)的能力，其表征指標(biāo)為酶催化該化學(xué)反應(yīng)的速度。而速度用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加量來確定。分析對(duì)象是作為藥物的酶。

酶法（續(xù)）（一）、酶活力測(cè)定法1、基本概念▲酶的活性單位(62酶法（續(xù)）

a）終點(diǎn)法：在適當(dāng)條件下，把酶和底物混合，測(cè)定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間。b）反應(yīng)速率法：該類方法是通過測(cè)定酶促反應(yīng)的速率從而表征酶活力，有兩種方法實(shí)現(xiàn)該速率的測(cè)定。其一、間斷一定時(shí)間或連續(xù)測(cè)定反應(yīng)指示量（如吸光度）的變化；其二、反應(yīng)間隔一定時(shí)間，停止反應(yīng)，測(cè)定底物減少或產(chǎn)物增加的量。▲酶活力測(cè)定的常用方法酶法（續(xù)）a）終點(diǎn)法：在適當(dāng)條件下，把酶和底物混合，測(cè)定63酶法（續(xù)）

2、酶促反應(yīng)的條件及影響因素酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，滿足于Michaelie-Menten方程（米氏方程），其表達(dá)式為：其中，——在一定底物濃度[S]時(shí)反應(yīng)的速率；Km——米氏常數(shù)；——在底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率?；谠摲匠蹋梢源_定酶促反應(yīng)速率與底物濃度[S]之間的定量關(guān)系。酶法（續(xù)）2、酶促反應(yīng)的條件及影響因素酶促反應(yīng)64酶法（續(xù)）

▲

條件選擇的基本要求為：所有待測(cè)定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。即，反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測(cè)定的酶濃度是影響速度的唯一因素外，其它因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。由于酶的不穩(wěn)定性，易于失活，因此，反應(yīng)條件的選擇就顯得極其重要，主要的影響因素是底物、溫度和PH值。酶法（續(xù)）▲條件選擇的基本要求為：由于酶的不穩(wěn)65酶法（續(xù)）

（1）、底物a）、底物的性質(zhì)應(yīng)在物理化學(xué)性質(zhì)上與產(chǎn)物不同，以便于產(chǎn)物的測(cè)定。b）、底物的濃度應(yīng)足夠的高。將使酶反應(yīng)的速度不受其影響。此時(shí)，反應(yīng)速率僅與酶量成正比，從而由速率測(cè)定確定酶含量。一般選擇[S]=100Km。c）、大多數(shù)酶具有相對(duì)專一性，在可被酶作用的各種底物中一般選擇Km小的底物，這樣可以減少酶的用量?！诿复俜磻?yīng)條件選擇的基本要求，主要考慮的影響因素有以下幾方面：酶法（續(xù)）（1）、底物▲基于酶促反應(yīng)條件選擇的基本要求，主66酶法（續(xù)）

（2）溶液PH溶液PH對(duì)酶促反應(yīng)將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，在測(cè)定時(shí)，不但要選擇適宜的反應(yīng)PH，而且要將反應(yīng)維持在該P(yáng)H值。其影響主要表現(xiàn)在以下幾方面：a）它可能改變酶的活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性；b）可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致酶失效；c）可能作用于反應(yīng)系統(tǒng)的其它組成成分，從而影響酶反應(yīng)，甚至改變可逆反應(yīng)進(jìn)行的方向。酶法（續(xù)）（2）溶液PH67酶法（續(xù)）

（3）溫度酶反應(yīng)對(duì)溫度十分敏感，因?yàn)闇囟饶苤苯佑绊懟瘜W(xué)反應(yīng)速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機(jī)制。一般而言，溫度變化1℃，酶反應(yīng)速度可能相差5％左右。因此，實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在0.1℃以內(nèi)。酶反應(yīng)溫度通常選用25℃、30℃或37℃。（4）、輔助因子有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。

酶法（續(xù)）（3）溫度（4）、輔助因子68酶法（續(xù)）

（5）、空白和對(duì)照實(shí)驗(yàn)空白實(shí)驗(yàn)用于消除背景，噪音和其它一些未知影響因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。該實(shí)驗(yàn)可通過不加酶、或不加底物，或二者都加(但酶需預(yù)先經(jīng)過失效處理)來實(shí)現(xiàn)。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：在濃度與測(cè)定量之間無準(zhǔn)確的關(guān)系，或計(jì)量關(guān)系易受條件影響時(shí)，通常用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑進(jìn)行測(cè)定，從而確定濃度與測(cè)定量之間的計(jì)量關(guān)系。酶法（續(xù)）（5）、空白和對(duì)照實(shí)驗(yàn)69酶法（續(xù)）

3、測(cè)定方法測(cè)定方法按取樣和檢測(cè)方式可分為取樣測(cè)定法和連續(xù)測(cè)定法。（1）取樣測(cè)定法在酶反應(yīng)開始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法,即為取樣測(cè)定法。酶法（續(xù)）3、測(cè)定方法測(cè)定方法按取樣和檢測(cè)方式可70酶法（續(xù)）

a）加入酶的變性劑，使其酶失去專一性的催化活性。

b）由于酶對(duì)溫度極為敏感，往往可以采用加熱使酶失活，從而停止反應(yīng)?！Ｖ姑复俜磻?yīng)的常用方法：c）基于酶促反應(yīng)對(duì)溶液PH較敏感，若反應(yīng)必須在適當(dāng)?shù)腜H范圍，否則反應(yīng)將停止，且無其它副反應(yīng)時(shí)，就可以采用改變PH的辦法終止反應(yīng)。酶法（續(xù)）a）加入酶的變性劑，使其酶失去專一性的催化活性。71酶法（續(xù)）

例如，三氯醋酸是一種高效專一的蛋白質(zhì)變性劑和沉淀劑，其缺點(diǎn)是在紫外光區(qū)有吸收.

高氯酸沒有上述缺點(diǎn)，并且用氫氧化鉀中和、冷卻后，KCIO4還可沉淀除去，但它不適于對(duì)酸和氧化劑敏感的測(cè)定對(duì)象。

酶法（續(xù)）例如，三氯醋酸是一種高效專一的蛋白質(zhì)變性劑和沉淀72酶法（續(xù)）

（2）連續(xù)測(cè)定法根據(jù)底物與產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)方面的差異，在反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)、在線測(cè)定底物或產(chǎn)物的變化量,即為連續(xù)測(cè)定法。

▲特點(diǎn)a)準(zhǔn)確性和測(cè)定效率均高于取樣測(cè)定法。b)對(duì)檢測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)儀器均要求較高，既要求檢測(cè)要快速，又要求準(zhǔn)確性和靈敏度要高，有時(shí)甚至要時(shí)間分辨。c)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)是當(dāng)今分析檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向，因此連續(xù)測(cè)定法為當(dāng)前重要的檢測(cè)技術(shù)。酶法（續(xù)）（2）連續(xù)測(cè)定法▲特點(diǎn)a)準(zhǔn)確性和測(cè)定效率均73酶法（續(xù)）

（3）檢測(cè)方法酶法（續(xù)）（3）檢測(cè)方法74酶法（續(xù)）

4、反應(yīng)速度的測(cè)定與要求酶活力測(cè)定的目的，就是要通過酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量，因此，測(cè)定的要求即為反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系。反應(yīng)速率的測(cè)定是通過“酶反應(yīng)進(jìn)程曲線”而實(shí)現(xiàn)，其曲線的鈄率即為酶反應(yīng)速率?！阜磻?yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線的特點(diǎn)僅在反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速度與酶濃度間才會(huì)出現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該線性關(guān)系才能應(yīng)用于酶濃度測(cè)定，該反應(yīng)體系才是該酶濃度測(cè)定的適宜體系。

酶法（續(xù)）4、反應(yīng)速度的測(cè)定與要求酶活力測(cè)定的目的，75酶法（續(xù)）

酶法（續(xù)）76酶法（續(xù)）

a)制備兩條曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線。從前者求得反應(yīng)初速度，根據(jù)初速度繪制酶濃度曲線，并通過后者來檢驗(yàn)酶反應(yīng)測(cè)定系統(tǒng)是否適宜。c)在較多的時(shí)候，初始進(jìn)程曲線并不是明顯的直線，此時(shí)曲線的初始鈄率即為酶的活性。此時(shí)，反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定也就要盡可能準(zhǔn)確?！笣舛葴y(cè)定的具有要求b)初始測(cè)定點(diǎn)（包括零時(shí)點(diǎn)）應(yīng)盡可能多（至少3-5個(gè)點(diǎn)），以保證在較低的產(chǎn)物濃度時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定酶的活性。酶法（續(xù)）a)制備兩條曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線77酶法（續(xù)）

（二）、酶分析法酶分析法是一種以酶為分析工具的分析方法，分析對(duì)象即為與酶反應(yīng)有關(guān)的非酶物質(zhì)。

▲

分析對(duì)象：底物、輔酶、酶活化劑、酶抑制劑。

▲分析方法a)動(dòng)力學(xué)分析法：可以應(yīng)用于底物、輔酶、酶活化劑、酶抑制劑。b)總變量分析法：實(shí)際上，即就是終點(diǎn)法，或者稱為平衡法，該方法僅能應(yīng)用于底物濃度的測(cè)定?！Ｕ€：上述兩類方法測(cè)定濃度均需使用校正曲線。酶法（續(xù)）（二）、酶分析法▲分析對(duì)象：底物、輔酶、酶活化78酶法（續(xù)）

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基本原理選擇適宜的反應(yīng)控制條件，使被測(cè)物（底物、輔酶、活化劑、抑制劑等其中之一）的濃度為影響酶促反應(yīng)速率的唯一因素，此時(shí)酶反應(yīng)速度僅與被測(cè)物濃度存在確定的比例關(guān)系，通過測(cè)定該反應(yīng)速度就可確定被測(cè)物的濃度。

1、動(dòng)力學(xué)分析法酶法（續(xù)）▲基本原理1、動(dòng)力學(xué)分析法79酶法（續(xù)）

注意

a）動(dòng)力學(xué)分析中通常使被測(cè)物以外的其它組分處于恒定和最適。上述的“唯一因素”，在實(shí)際應(yīng)用中，往往很難達(dá)到要求，僅能使其它影響因素盡可能減小，使被測(cè)物濃度成為影響酶促反應(yīng)速度的主要因素。

b)校正系統(tǒng)與測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)完全相同。在測(cè)定未知樣品時(shí)，所采用的反應(yīng)、測(cè)定系統(tǒng)和制備標(biāo)準(zhǔn)校正曲線時(shí)所用的系統(tǒng)應(yīng)完全相同，而且待測(cè)樣品的濃度還應(yīng)控制在這一曲線范圍以內(nèi)。酶法（續(xù)）注意a）動(dòng)力學(xué)分析中通常使被測(cè)物以外的80酶法（續(xù)）

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動(dòng)力學(xué)測(cè)定法的四種測(cè)定系統(tǒng)

a）被測(cè)物是酶的底物從米氏方程可知，當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]Km時(shí)，酶反應(yīng)速度與底物濃度成正比，即υ＝k[S]，酶反應(yīng)相對(duì)底物而言為一級(jí)反應(yīng)，因此測(cè)定酶反應(yīng)速度可以得知其濃度。

b）被測(cè)物是輔酶需要輔酶Ⅰ(NAD)、輔酶Ⅱ(NADP)、輔酶A(CoA)之類輔酶的反應(yīng)可看作是雙底物反應(yīng)。當(dāng)另一類底物濃度足夠高時(shí)，反應(yīng)變?yōu)閱蔚孜锓磻?yīng),反應(yīng)速度將與輔酶濃度成正比。

酶法（續(xù)）▲動(dòng)力學(xué)測(cè)定法的四種測(cè)定系統(tǒng)a）被測(cè)81酶法（續(xù)）

示例:以CoA的測(cè)定為例基于它是—酮戊二酸脫氫酶的輔酶的特點(diǎn),即-酮戊二酸+CoA+NAD+琥珀酰-CoA+NADH+CO2

當(dāng)?shù)孜?酮戊二酸和NAD處于足夠高的濃度時(shí)，反應(yīng)速度與CoA的濃度成正比。此反應(yīng)可通過NADH在340nm處特征峰吸收度的變化來測(cè)定。酶法（續(xù)）示例:以CoA的測(cè)定為例基于它是—酮戊二82酶法（續(xù)）

c）被測(cè)物為活化劑當(dāng)其他條件最適且一定時(shí)，活化劑在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內(nèi)具有線性比例關(guān)系。

用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定時(shí)應(yīng)注意兩個(gè)問題①、活化劑濃度超過一定水平后常導(dǎo)致抑制.②、對(duì)于某一種酶，相似的離子往往也能表現(xiàn)出活化作用，因此測(cè)定不專一，易受到干擾。酶法（續(xù)）c）被測(cè)物為活化劑當(dāng)其他條件最適且一定83酶法（續(xù)）

d）被測(cè)物是抑制劑不可逆抑制劑對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生的抑制程度隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應(yīng)的最終抑制程度由抑制劑的絕對(duì)量決定.不可逆抑制劑可逆抑制劑在底物濃度一定時(shí)，在低的抑制劑濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低?？赡嬉种苿┟阜ǎɡm(xù)）d）被測(cè)物是抑制劑不可逆抑制劑對(duì)酶反應(yīng)84酶法（續(xù)）

▲

基本原理根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，然后在反應(yīng)完成后，借助物理化學(xué)方法測(cè)出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測(cè)物的實(shí)際含量或濃度的一種分析方法。僅適用于底物的測(cè)定。

2、總變量分析法(終點(diǎn)法或平衡法)酶法（續(xù)）▲基本原理2、總變量分析法(終點(diǎn)法或平衡法)85酶法（續(xù)）

分析方法的幾個(gè)重要問題

①、被測(cè)底物的濃度應(yīng)很小，并控制反應(yīng)于一級(jí)反應(yīng)水平。防止過多的產(chǎn)物生成，避免逆反應(yīng)。

②、其它因素應(yīng)盡量處于最適水平，雙底物反應(yīng)的另一底物應(yīng)具有足夠高的濃度。

反應(yīng)本身要求酶的用量要高，以保證較快地達(dá)到終點(diǎn)，但由于酶的價(jià)格昂貴，因此適宜用量即為一個(gè)重要問題。

③、酶的用量要適宜。一般而言，工具酶用量可控制在l-2Km單位(U/m1)左右。而終點(diǎn)法的測(cè)定時(shí)間多控制在2-l0min。酶法（續(xù)）分析方法的幾個(gè)重要問題①、被測(cè)底物的濃度86酶法（續(xù)）

（三）、酶法應(yīng)用示例

示例一、胰蛋白酶效價(jià)測(cè)定▲基本原理胰蛋白酶能專一地水解肽鍵、酰胺鍵及酯鍵。目前底物采用專屬性較高的N-苯甲?！狶—精氨酸乙酯，在胰蛋白酶作用下水解為N-苯甲?！狶—精氨酸。通過底物在253nm處體系吸光度的變化速率來表達(dá)酶促反應(yīng)的速率，從而用該連續(xù)測(cè)定法測(cè)定胰蛋白酶的效價(jià)?！鴾y(cè)定方法：請(qǐng)參見教材p341酶法（續(xù)）（三）、酶法應(yīng)用示例示例一、胰蛋白酶效價(jià)測(cè)定87酶法（續(xù)）

示例二、胃蛋白酶的活力測(cè)定▲基本原理胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸，同時(shí)基于三氯醋酸使血紅蛋白變性而沉淀的性質(zhì)，使蛋白水解反應(yīng)終止。從而利用取樣測(cè)定法（或終止反應(yīng)法）測(cè)定胃蛋白酶的活性，其水解產(chǎn)物氨基酸濃度的變化速度將根據(jù)水解產(chǎn)物中酪氨酸在275nm處的紫外吸收進(jìn)行測(cè)定?！鴾y(cè)定方法：請(qǐng)參見教材p342酶法（續(xù)）示例二、胃蛋白酶的活力測(cè)定▲基本原理胃蛋88三、電泳法在電解質(zhì)溶液中，不同的帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同的遷移速度向其所帶電荷相反的方向進(jìn)行電極遷移?；诓煌Ｗ拥奶囟ㄟw移速度，使組分分離成狹窄的組分帶，從而分析檢測(cè)相應(yīng)的物質(zhì)。（一）電泳法的基本原理和分類遷移速度服從于下述方程：v=ueE其中，v為離子移動(dòng)速度，E為電場(chǎng)強(qiáng)度，ue為電泳遷移率?！驹砣㈦娪痉ㄔ陔娊赓|(zhì)溶液中，不同的帶電粒子在電場(chǎng)89電泳法（續(xù)）

遷移速度服從于下述方程：v=ueE其中，v為離子移動(dòng)速度，E為電場(chǎng)強(qiáng)度，ue為電泳遷移率。電泳遷移率ue，在介質(zhì)一定時(shí)，其值僅與帶電粒子的性質(zhì)有關(guān)，為其特性常數(shù)，據(jù)此對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定?！诸愲娪痉ǎɡm(xù)）遷移速度服從于下述方程：電泳遷移率ue，在介質(zhì)90電泳法（續(xù)）

在電場(chǎng)作用下，溶液中的同種分子具有相同的泳動(dòng)速度，不同種類的分子其泳動(dòng)速度不同。電場(chǎng)將逐漸密集同種分子，而與其他電泳速度不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面，從而進(jìn)行分離鑒定。▲基本原理▲特點(diǎn)a)、在溶液中電泳，無惰性支持介質(zhì)。b)、不同種類物質(zhì)之間形成界面，這種界面可以是完全分離的，也可以是部分分離的。1、自由界面電泳(Moving-boundaryElectrophoresis)電泳法（續(xù)）在電場(chǎng)作用下，溶液中的同種分子具有相同91電泳法（續(xù)）

惰性介質(zhì)支持的溶液組分，在電場(chǎng)作用下，基于不同組分與惰性介質(zhì)的物理相互作用的差異以及不同組分的電學(xué)性質(zhì)差異，使不同組分在該介質(zhì)上具有不同的泳動(dòng)速度，形成各自組分的區(qū)帶，從而分離、分析溶液組分?！驹?、區(qū)帶電泳(ZoneElectrophoresis)▲特點(diǎn)a)、存在惰性支持介質(zhì)。b)、電泳最終會(huì)使不同組分形成明顯的分離區(qū)帶，具有較好的分離性。電泳法（續(xù)）惰性介質(zhì)支持的溶液組分，在電場(chǎng)作用下，92電泳法（續(xù)）

HPCE是離子或荷電粒子以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管中按其淌度或（和）分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的一種電泳新技術(shù)?！驹?、高效毛細(xì)管電泳(HighPerformanceCapillaryElectrophoresis,i.e.HPCE)▲特點(diǎn)a)、高效、快速、樣品用量少。b)、容易自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)便、溶劑消耗少、環(huán)境污染小電泳法（續(xù)）HPCE是離子或荷電粒子以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力93電泳法（續(xù)）

用濾紙作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。▲測(cè)定方法a)選擇緩沖液：基于供試品的性質(zhì)、電泳速度和分辨率，考察緩沖液的組成、pH值和離子強(qiáng)度。b）剪裁濾紙：寬度由樣點(diǎn)數(shù)確定，樣點(diǎn)間距為2-3cm；長度由電源輸出最高電壓及所需的電場(chǎng)強(qiáng)度而定，電壓恒定時(shí)，所需場(chǎng)強(qiáng)越大，濾紙裁得越短。1、紙電泳法（二）常用(區(qū)帶)電泳法的類型及其應(yīng)用電泳法（續(xù)）用濾紙作為支持介質(zhì)的一種電泳方法?！?4電泳法（續(xù)）

干點(diǎn)法將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干，再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕。c）點(diǎn)樣：干點(diǎn)法和濕點(diǎn)法。

濕點(diǎn)法是將濾紙全部浸入緩沖液中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，濾紙點(diǎn)樣部分需用架子架起，點(diǎn)的次數(shù)不宜過多，稀的供試品溶液應(yīng)預(yù)先濃縮。點(diǎn)樣后立即通電以免擴(kuò)散。電泳法（續(xù)）干點(diǎn)法將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹95電泳法（續(xù)）

電泳條件——電壓、電流和電泳時(shí)間。d）電泳與區(qū)帶顯示

e）定量測(cè)定：用洗脫法或光密度計(jì)掃描法。顯色方法——電泳后晾干或烘干的濾紙可以采用紫外燈定位和顯色劑顯色等不同的顯色方法。目前光密度計(jì)掃描法已被醋酸纖維素薄膜電泳法取代。這是因?yàn)樵诩堧娪痉ㄖ?，支持物濾紙對(duì)蛋白質(zhì)樣品的吸附力較大，且濾紙本身為極性物，透明化步驟較煩，不利于光密度計(jì)掃描法定量測(cè)定。電泳法（續(xù)）電泳條件——電壓、電流和電泳時(shí)間。d）電96電泳法（續(xù)）

▲應(yīng)用

紙電泳法一般用于小分子荷電物質(zhì)的分離，如氨基酸、蛋白質(zhì)、小肽、核苷酸等。由于小分子凈電荷較少，與濾紙和極性大的物質(zhì)分子相互作用，使它們的泳動(dòng)遷移較慢，因此，有時(shí)紙電泳需要在高壓（約200V/cm）下進(jìn)行，而高壓又會(huì)產(chǎn)生熱量，使緩沖液大量蒸發(fā)及濾紙干燥，為此必須附有降溫設(shè)備，或置于低溫條件下進(jìn)行。電泳法（續(xù)）▲應(yīng)用紙電泳法一般用于小分子荷電97電泳法（續(xù)）

以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳方法，其原理與電泳基本相同。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯，將其溶于有機(jī)溶劑后，涂布成均勻細(xì)密的微孔薄膜?！椒ǖ奶攸c(diǎn)a)有效消除紙電泳中經(jīng)常出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景清晰，分離區(qū)帶狹窄清楚，使方法的精確性提高。2、醋酸纖維素薄膜電泳b)樣品用量少、靈敏度高。分離速度快、電泳時(shí)間短。薄膜電泳圖易于透明化。電泳法（續(xù)）以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳98電泳法（續(xù)）

以人工合成的聚丙烯酰胺凝膠作為惰性支持介質(zhì)的一種電泳方法。凝膠具有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩作用。在電泳過程中，對(duì)于相同凝膠的分離效果主要取決于粒子電荷、樣品分子大小和形狀。3、聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）4、十二烷基磺酸鈉（SDS）——PAGE電泳當(dāng)在PAGE系統(tǒng)中加入SDS時(shí)，電遷移率主要取決于分子量大小，而分子所帶靜電荷、分子大小和形狀等其它因素對(duì)其影響幾乎可以忽略不計(jì)。因此，SDS—PAGE法不僅可以根據(jù)分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行分離，而且可以根據(jù)電泳遷移率大小測(cè)定生物大分子的分子量。電泳法（續(xù)）以人工合成的聚丙烯酰胺凝膠作為惰性支持介99電泳法（續(xù)）

本法是以瓊脂糖為基質(zhì)的電泳方法，主要應(yīng)用于DNA、RNA等核糖核酸類及其衍生物藥物的分離，以及分離、鑒定和純化DNA片段。其電遷移速率主要取決于瓊脂糖濃度，核酸分子大小與形狀等三個(gè)因素。5、瓊脂糖凝膠電泳法電泳法（續(xù)）本法是以瓊脂糖為基質(zhì)的電泳方法，主要應(yīng)用100四、生物檢定法生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體(整體動(dòng)物、離體組織、微生物等)的作用，以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。

1）測(cè)定工具：整體動(dòng)物、離體組織、衍生物等生物體的藥理作用過程與藥效。

▲基本原理▲生物檢測(cè)法的顯著特點(diǎn)

四、生物檢定法生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體(整101生物檢定法(續(xù))2）測(cè)定結(jié)果：多個(gè)生物體實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果誤差大，條件難以控制，結(jié)果重現(xiàn)性差。這些現(xiàn)象均是由于生物體的個(gè)別差異較大所引起的。藥物的效價(jià)測(cè)定、微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定、藥物質(zhì)量控制、某些有害雜質(zhì)的限度檢查。

▲應(yīng)用范圍

3）生物測(cè)定法主要用于無適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定的藥物，它是理化檢測(cè)法的補(bǔ)充方法。

生物檢定法(續(xù))2）測(cè)定結(jié)果：多個(gè)生物體實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的統(tǒng)計(jì)結(jié)果102第十三章生物制品分析概論

第十三章生物制品分析概論103第一節(jié)概述藥物的三大類:第一節(jié)概述藥物的三大類:104一、生化藥物與基因工程藥物的定義生化藥物:一般系指以下三種途徑獲得的藥物：其一，從動(dòng)物、植物及微生物分離純化；其二、生物——化學(xué)半合成；其三，現(xiàn)代生物技術(shù)制取。該類藥物主要包括：生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物、大分子結(jié)構(gòu)修飾物等。例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、核苷酸和脂等。一、生化藥物與基因工程藥物的定義生化藥物:一般系指以下三105續(xù)定義基因工程藥物:在確定了對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上,分離、純化或人工合成控制該蛋白質(zhì)合成的基因，并利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中進(jìn)行繁殖或表達(dá)

，從而大規(guī)模生產(chǎn)出具有預(yù)防和治療疾病作用的藥用蛋白質(zhì)。續(xù)定義基因工程藥物:在確定了對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用106二、生化藥物與基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類二、生化藥物與基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類107種類（續(xù)）氨基酸及其衍生物類藥物1、單氨基酸例如：亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、色氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、蘇氨酸等等。2、氨基酸衍生物例如：N-乙酰上-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽、S—氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸等等。3、復(fù)合氨基酸注射液例如：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液。S代表氨基酸的種類。種類（續(xù)）氨基酸及其衍生物類藥物108種類（續(xù)）藥用活性多肽1、垂體多肽：例如：促胃液素(5肽)、催產(chǎn)素(9肽)等。2、消化道多肽：例如：胃泌素(14肽，17肽和34肽三種)3、下丘腦多肽：例：促甲狀腺素釋放激素(3肽)。4、腦多肽：例：新啡肽(25肽)，-內(nèi)啡肽(3l肽)等。5、激肽類：例：血管緊張肽I(10肽)、Ⅱ(8肽)、Ⅲ(7肽

)等活性肽。6、其它肽類：例：谷胱甘肽(3肽)、1胸腺素(28肽)。

種類（續(xù)）藥用活性多肽109種類（續(xù)）藥物蛋白質(zhì)1、蛋白激素類藥物：例如：胰島素、生長激素、催產(chǎn)素。2、天然蛋白質(zhì)類藥物：例如：血清白蛋白、干擾素。3、蛋白質(zhì)類藥物制劑：例如：明膠海綿、氧化聚明膠。種類（續(xù)）藥物蛋白質(zhì)110種類（續(xù)）酶與輔酶類藥物1、助消化酶類：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶類：例：溶菌酶、胰DNA酶、膠原蛋白酶。3、凝血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纖溶酶、尿激酶。4、抗腫瘤酶：例：L-天門冬酰胺酶、組氨酸酶、精氨酸酶。5、其它酶類：例：超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、DNA酶、青霉素酶。6、輔酶類藥物：輔酶對(duì)酶的催化反應(yīng)起著促進(jìn)作用。例：輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、輔酶Q10、黃素單核苷酸。種類（續(xù)）酶與輔酶類藥物111種類（續(xù)）多糖類藥物該類藥物來源廣泛，以黏多糖為主，其特點(diǎn)為：（1）、由糖苷鍵將單糖連接而成多糖。（2）、因單糖結(jié)構(gòu)糖苷鍵位置不同，使多糖種類繁多，藥理功能各異。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。例如：肝素、硫酸軟骨素A和C、刺參多糖、銀耳多糖、人胎盤脂多糖、殼聚多糖。種類（續(xù)）多糖類藥物例如：肝素、硫酸軟骨素A和C、刺參多糖、112種類（續(xù)）脂質(zhì)類藥物1、磷脂：如腦磷脂、卵磷脂。2、降血脂：如天然亞油酸、亞麻酸、多價(jià)不飽和脂肪酸（PUFA）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、PGI2。3、膽酸：如去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸。4、固醇：如膽固醇、麥角固醇、-谷固醇。5、卟啉：如血紅素、膽紅素、原卟啉。

種類（續(xù)）脂質(zhì)類藥物113種類（續(xù)）核酸及其降解物和衍生物類藥物1、核酸：例如，從小牛胸腺或魚精中提取的DNA可用于治療精神遲緩、虛弱和抗輻射。2、多聚核苷酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干擾素的誘導(dǎo)劑，用于抗病毒、抗腫瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物：例，ATP、cAMP、CDP-膽堿、AMP、肌苷等。也可將它們進(jìn)行化學(xué)修飾后用于治療腫瘤和病毒感染。治療腫瘤的如6-巰基嘌呤、2-脫氧核苷?？共《镜娜纾h(huán)胞苷、

5-碘苷。

種類（續(xù)）核酸及其降解物和衍生物類藥物114（二）、基因工程類藥物的種類（二）、基因工程類藥物的種類115三、生化藥物與基因工程藥物的特點(diǎn)1、共同特點(diǎn)：

均來自生物體,是生物體的基本生化成分,具有生物活性或生理功能,對(duì)疾病具有針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小、易于人體吸收。2、分子量大且不是定值小部分藥物（如：氨基酸、輔酶）屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物，大部分為大分子的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等)，其分子量一般幾千至幾十萬。對(duì)大分子的生化藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。所以，生化藥物常需進(jìn)行分子量的測(cè)定。

三、生化藥物與基因工程藥物的特點(diǎn)1、共同特點(diǎn)：2、分子量大且116特點(diǎn)（續(xù)）3．結(jié)構(gòu)確證難由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用元素分析、紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實(shí)。

4、全過程質(zhì)量控制該類藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬等均較敏感，往往需要對(duì)原料藥、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品進(jìn)行全過程質(zhì)量控制，且要求比其它藥物更為嚴(yán)格。5．需檢查生物活性在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時(shí)，有時(shí)因工藝條件的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。因此，對(duì)這些生化藥物，除了用通常采用的理化法檢驗(yàn)外。尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實(shí)其生物活性。

特點(diǎn)（續(xù)）3．結(jié)構(gòu)確證難4、全過程質(zhì)量控制5．需檢查生物活性117特點(diǎn)（續(xù)）6．需做安全性檢查由于生化藥物的性質(zhì)特殊。生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)。故生化藥物常需做安全性檢查，如熱原檢查、過敏試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)等。

7．需做效價(jià)測(cè)定該類藥物多數(shù)可通過含量測(cè)定，以表明其主藥的含量。但對(duì)酶類藥物需進(jìn)行效價(jià)測(cè)定或酶活力測(cè)定，以表明其有效成分含量的高低。

特點(diǎn)（續(xù)）6．需做安全性檢查7．需做效價(jià)測(cè)定118第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法

一、鑒別試驗(yàn)

真?zhèn)舞b別方法

化學(xué)藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法生化藥物與基因工程藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法、生物學(xué)方法。且需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤M(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法一、鑒別試驗(yàn)真?zhèn)舞b119（一）、理化鑒別

1、化學(xué)鑒別法

利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。

例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶茵酶分子中的四個(gè)肽鍵上的氮原子能與銅離子(Cu2+)絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。（一）、理化鑒別1、化學(xué)鑒別法例如，溶菌酶的鑒別采用呈120理化鑒別(續(xù))

2、紫外分光光度法由于很多生物大分子均有共軛系統(tǒng),可產(chǎn)生特征可見紫外吸收，使較多藥物能夠用紫外分光光度法的特征吸收進(jìn)行鑒別。例如，0.0lmol/L的三磷酸腺苷二鈉的鹽酸水溶液在257nm的波長處有最大吸收。用A250nm/A260nm的值0.17-0.27進(jìn)行鑒別。理化鑒別(續(xù))2、紫外分光光度法例如，0.0lmol/L121理化鑒別(續(xù))

3、高效液相色譜法利用對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。例如，重組人生長激素的鑒別：1）供試品與對(duì)照品的主峰保留時(shí)間一致。2）供試品與對(duì)照品的肽圖譜保持一致性。理化鑒別(續(xù))3、高效液相色譜法例如，重組人生長激素的鑒122（二）、生化鑒別

1、酶法由于酶催化化學(xué)反應(yīng)的高度專一性，利用特定的酶僅能催化特定的化學(xué)反應(yīng)，可以有效地鑒別該藥物。

例如，尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原．而具有相同作用的

鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。（二）、生化鑒別1、酶法例如，尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解123生化鑒別(續(xù))

2、電泳法基于生物大分子分子量的較大差異和荷電的差異，在電泳法中具有不同的遷移距離，從而鑒別生化藥物。例如，肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場(chǎng)作用下，向正極方向移動(dòng)，與肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置應(yīng)對(duì)應(yīng)。生化鑒別(續(xù))2、電泳法例如，肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：124生化鑒別(續(xù))

3、樣品脫鹽后用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定基因工程藥物往往有多個(gè)等電點(diǎn)，利用等電點(diǎn)聚焦從而形成多個(gè)區(qū)帶，基于該區(qū)帶的一致性鑒別藥物。

（三）．生物鑒別法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例如，用家兔驚厥試驗(yàn)來鑒別胰島素，它是通過胰島素的降血糖作用進(jìn)行鑒別的。當(dāng)劑量過大，血糖降低至一定水平(約30％)，家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50％葡萄糖注射液，補(bǔ)充血糖、驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。生化鑒別(續(xù))3、樣品脫鹽后用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定（三）．125▲生物藥物鑒別應(yīng)該注意以下三點(diǎn)：

（1）藥物的取樣：由于生物藥物多數(shù)為大分子藥物，有的化學(xué)結(jié)構(gòu)不明確，有的分子量不是定值，使質(zhì)量控制較為困難。在大量的樣品中取少量供試品進(jìn)行分析，應(yīng)考慮取樣的科學(xué)性、真實(shí)性和代表性，其基本原則是均勻、合理。

（2）鑒別結(jié)果評(píng)價(jià)：由于生化藥物的復(fù)雜性和不確定性，通常鑒別不是由一項(xiàng)試驗(yàn)完成，而是采用一組試驗(yàn)項(xiàng)目綜合評(píng)價(jià)一種藥物。

（3）目前仍存在相當(dāng)一部分生化藥物沒有找到有效的鑒別方法?！锼幬镨b別應(yīng)該注意以下三點(diǎn)：（1）藥物的取樣：由于生126二、雜質(zhì)檢查

1、一般雜質(zhì)檢查生化藥物的一般雜質(zhì)檢查項(xiàng)目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘?jiān)?。其檢查的原理及方法與化學(xué)藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同。

二、雜質(zhì)檢查1、一般雜質(zhì)檢查127雜質(zhì)檢查（續(xù)）

2．特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。

例如，胰蛋白酶是從動(dòng)物胰中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過程中，易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，根據(jù)糜蛋白酶的特性可以選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。

雜質(zhì)檢查（續(xù)）2．特殊雜質(zhì)檢查例如，胰蛋白酶是從動(dòng)物胰中提128三、安全性檢查

（一）、熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

詳見第十二章藥物制劑分析（P302-303）

（二）、異常毒性試驗(yàn)

異常毒性試驗(yàn)是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。

三、安全性檢查（一）、熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（二）、異129安全性檢查（續(xù)）

中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是一個(gè)限度試驗(yàn)。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗(yàn)動(dòng)物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物急性中毒而死亡，則反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過了正常水平，因此，本試驗(yàn)又稱異常毒性檢查法。

試驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠。試驗(yàn)方法：尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服給藥法。

安全性檢查（續(xù)）中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是130安全性檢查（續(xù)）

例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如：取體重17—22g的健康小白鼠5只，分別由皮下注射每1ml中含玻璃酸酶10000單位的氯化鈉注射液0.25ml，48h內(nèi)不得發(fā)生皮下組織壞死或死亡．如有一只小白鼠發(fā)生組織壞死或死亡，應(yīng)按上述方法復(fù)試，全部小白鼠在48h內(nèi)不得有組織壞死或死亡現(xiàn)象。安全性檢查（續(xù)）例如，玻璃酸酶的