(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261CHO細胞表達抗體2021/7/262CHO細胞表達抗體2021/7/262基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/263基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/26CHO（Chinesehamsterocary）CHO細胞生物技術產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的對蛋白質進行糖基化，其糖型與人類基本一致不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增遺傳背景清楚、轉染效率高、可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)2021/7/264CHO（Chinesehamsterocary）CHO細CHOClassification補充：1980年CHO-K1經(jīng)化學突變得到CHO-DXB11（一個等位基因缺失）1983年的電離輻射經(jīng)誘變株CHO-DG44（兩個等位基因缺失）由于CHO-DXB11

DHFR缺陷不徹底，很快被完全無DHFR活性的CHO-DG44取代注釋：ATCC

（AmericanTypeCultureCollection）美國菌種保藏中心ECACC（EuropeanCollectionofAuthenticatedCellCultures）歐洲細胞株/微生物保藏中心2021/7/265CHOClassification2021/7/265DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)LifeTechnology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系統(tǒng)LifeTechnology公司FreedomCHO-SKit宿主細胞：DG44質粒：共轉染PcDNA3.3（Neo抗性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX（氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s?Cells(cGMP-banked)質粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHOCell2021/7/266DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CH抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應策略整合位點弱化選擇標致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴增選擇標志基因轉錄強啟動子、增強子、強轉錄終止信號、適宜的抗體基因結構翻譯翻譯型增強子，適宜的抗體基因結構加工組裝輕重鏈表達平衡，宿主細胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導肽，適宜的抗體基因結構其他選擇適宜的宿主細胞、宿主細胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉錄、轉錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達量很大程度上由質粒載體的各表達調控元件及組織方式?jīng)Q定2021/7/267抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應策略整合位點弱化選擇標致基因CHO表達載體組成表達載體結構組成骨架序列選擇性標志基因表達盒特殊的調控序列2021/7/268CHO表達載體組成2021/7/268選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基因可自發(fā)在染色體上擴增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴增，共擴增序列可達上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構建瞬時表達載體。2021/7/269選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動子和相應的增強子是最關鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉錄起始頻率）常用的CHO細胞表達啟動子的轉錄活性依次為CMV啟動子>SV40啟動子>LTR啟動子2021/7/2610表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇

常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細胞，但是有報道CHO（DHFR-)細胞，很難馴化，生長也不好。DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳。2021/7/2611常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質粒共轉染CHO（DHFR-）宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長重組質粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。進一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因與其共轉染的目的基因一起擴增，提高目的蛋白表達。2021/7/2612PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質粒共轉GS系統(tǒng)

Sigma、藥明康德等公司都在自己構建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細胞：CHO-K1質粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司

1992年，Bebbington等首次使用GS基因細胞系統(tǒng)表達重組抗體

PEE12.42021/7/2613GS系統(tǒng)

瑞士的Lonza公司PEE12.4202PEE12.4412.42021/7/2614PEE12.442021/7/2614

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATPL-谷氨酰胺+ADP+PiGS2021/7/2615

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATP

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-banked）培液：CD-FortiCHOMedium限制性內切酶：AvrII/BstZ17I，EcoRV/Pacl線性化酶：NruI轉化：Neon?electroporationTransfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法2021/7/2616

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-ba四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。當葉酸類似物MTX不可逆結合后，阻止四氫葉酸合成。細胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理2021/7/2617四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。DH2021/7/26182021/7/2618CHO細胞的培養(yǎng)一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng)含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基2021/7/2619CHO細胞的培養(yǎng)2021/7/2619

基因合成與質粒構建（密碼子優(yōu)化）2-3weeks

轉化大腸桿菌TOP101-2weeks

轉染CHO-s2days

細胞pool篩選6-8weeks

單克隆Cell篩選4-5weeks

單克隆擴增、評估2-3weeks

擴大培養(yǎng)2021/7/26202021/7/26202021/7/26212021/7/2621小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達細胞株。大幅度加壓可以在短期內得到高表達克隆株細胞，但是細胞株表達不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后，表達水平往往下降。2021/7/2622小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達細胞株。2021/7THE

ENDTHANKYOU！2021/7/2623THEENDTHANKYOU！2021/7/26232021/7/26242021/7/2624(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/2625(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261CHO細胞表達抗體2021/7/2626CHO細胞表達抗體2021/7/262基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/2627基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/26CHO（Chinesehamsterocary）CHO細胞生物技術產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的對蛋白質進行糖基化，其糖型與人類基本一致不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增遺傳背景清楚、轉染效率高、可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)2021/7/2628CHO（Chinesehamsterocary）CHO細CHOClassification補充：1980年CHO-K1經(jīng)化學突變得到CHO-DXB11（一個等位基因缺失）1983年的電離輻射經(jīng)誘變株CHO-DG44（兩個等位基因缺失）由于CHO-DXB11

DHFR缺陷不徹底，很快被完全無DHFR活性的CHO-DG44取代注釋：ATCC

（AmericanTypeCultureCollection）美國菌種保藏中心ECACC（EuropeanCollectionofAuthenticatedCellCultures）歐洲細胞株/微生物保藏中心2021/7/2629CHOClassification2021/7/265DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)LifeTechnology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系統(tǒng)LifeTechnology公司FreedomCHO-SKit宿主細胞：DG44質粒：共轉染PcDNA3.3（Neo抗性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX（氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s?Cells(cGMP-banked)質粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHOCell2021/7/2630DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CH抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應策略整合位點弱化選擇標致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴增選擇標志基因轉錄強啟動子、增強子、強轉錄終止信號、適宜的抗體基因結構翻譯翻譯型增強子，適宜的抗體基因結構加工組裝輕重鏈表達平衡，宿主細胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導肽，適宜的抗體基因結構其他選擇適宜的宿主細胞、宿主細胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉錄、轉錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達量很大程度上由質粒載體的各表達調控元件及組織方式?jīng)Q定2021/7/2631抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應策略整合位點弱化選擇標致基因CHO表達載體組成表達載體結構組成骨架序列選擇性標志基因表達盒特殊的調控序列2021/7/2632CHO表達載體組成2021/7/268選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基因可自發(fā)在染色體上擴增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴增，共擴增序列可達上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構建瞬時表達載體。2021/7/2633選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動子和相應的增強子是最關鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉錄起始頻率）常用的CHO細胞表達啟動子的轉錄活性依次為CMV啟動子>SV40啟動子>LTR啟動子2021/7/2634表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇

常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細胞，但是有報道CHO（DHFR-)細胞，很難馴化，生長也不好。DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳。2021/7/2635常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質粒共轉染CHO（DHFR-）宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長重組質粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。進一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因與其共轉染的目的基因一起擴增，提高目的蛋白表達。2021/7/2636PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質粒共轉GS系統(tǒng)

Sigma、藥明康德等公司都在自己構建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細胞：CHO-K1質粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司

1992年，Bebbington等首次使用GS基因細胞系統(tǒng)表達重組抗體

PEE12.42021/7/2637GS系統(tǒng)

瑞士的Lonza公司PEE12.4202PEE12.4412.42021/7/2638PEE12.442021/7/2614

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATPL-谷氨酰胺+ADP+PiGS2021/7/2639

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATP

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-banked）培液：CD-FortiCHOMedium限制性內切酶：AvrII/BstZ17I，EcoRV/Pacl線性化酶：NruI轉化：Neon?electroporationTransfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法2021/7/2640

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-ba四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。當葉酸類似物MTX不可逆結合后，阻止四氫葉酸合成。細胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理2021/7/2641四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。DH2021/7/26422021/7/2618CHO細胞的培養(yǎng)一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng)含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基2021/7/2643CHO細胞的培養(yǎng)2021/7/2619

基因合成與質粒構建（密碼子優(yōu)化）2-3weeks