第三章基因芯片的制作方法第三章基因芯片的制作方法3.1概述

1.基因芯片是以Southern印跡雜交技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。

反向雜交技術(shù)3.1概述1.基因芯片是以Southern印跡雜2.基因芯片的制作方法：

原位合成法：Affymetrix公司

直接點(diǎn)樣法（合成后點(diǎn)樣）：Stanford大學(xué)，1995年2.基因芯片的制作方法：項(xiàng)目原位合成法直接點(diǎn)樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因組DNA，蛋白等探針長度約25nt不限制聯(lián)合合成需要不需要芯片表面點(diǎn)樣不需要需要密度高低制作成本高低應(yīng)用基因表達(dá)，突變檢測基因表達(dá)，突變檢測，CGH項(xiàng)目原位合成法直接點(diǎn)樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡1.常見的載體類型

膜

玻片

三維基質(zhì)包被玻片3.2芯片載體的制作1.常見的載體類型3.2芯片載體的制作（1）膜

優(yōu)點(diǎn)：與核酸親和力強(qiáng)。

缺點(diǎn)：單位面積上點(diǎn)樣密度低；

背景較高；

靈敏度低。（1）膜（2）玻片

優(yōu)點(diǎn)：耐受高溫和高離子強(qiáng)度；

具有不浸潤性，提高點(diǎn)樣密度；背景低。

缺點(diǎn)：二維的平面結(jié)構(gòu)，與DNA雜交時(shí)會有空間位阻。（2）玻片（3）三維基質(zhì)包被玻片

具有三維孔性結(jié)構(gòu)，更適合做蛋白質(zhì)芯片的支持物，可以保持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，不影響它的活性。（3）三維基質(zhì)包被玻片表1基因芯片不同載體性能對比載體類別陣列密度所需探針量檢測方法標(biāo)記膜低高放射性單色玻片高低多種彩色表1基因芯片不同載體性能對比載體類別陣列密度所需探針量檢測2.探針分子與基片表面的作用方式

化學(xué)偶聯(lián)：探針分子與基片表面活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成新的共價(jià)鍵。

物理吸附：探針分子與基片表面通過次級鍵相連接。2.探針分子與基片表面的作用方式3.玻片的修飾類型氨基修飾玻片同型雙功能偶聯(lián)劑修飾的玻片硫醇基修飾的玻片環(huán)氧硅烷化修飾的玻片等3.玻片的修飾類型圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片羥基氨基圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片對苯乙異硫氰酸（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基醛基戊二醛醛基圖3-6寡核苷酸探針固定在PDC基片上的原理連接分子手臂分子特異性探針圖3-6寡核苷酸探針固定在PDC基片上的原理連接分子手臂圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇基修飾的玻片硫醇基圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片環(huán)氧硅烷基圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片圖3-9在硅烷化玻片上生成樹形連接分子系統(tǒng)的示意（5）聚酰胺樹形連接分子系統(tǒng)修飾的玻片圖3-9在硅烷化玻片上生成樹形連接分子系統(tǒng)的示意（5）聚1.cDNA探針2.寡核苷酸探針3.基因組DNA探針（很少用）3.3探針的制備1.cDNA探針3.3探針的制備cDNA探針：

主要來自cDNA文庫，從細(xì)胞或組織中提取RNA后逆轉(zhuǎn)。cDNA探針：寡核苷酸探針：

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的基因序列人工合成的。

通常在5’末端進(jìn)行氨基修飾，并加入一段不直接參與雜交的重復(fù)序列，稱為手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特異性探針寡核苷酸探針：手臂分子特異性探針表2寡核苷酸與cDNA對比類別需要序列種類交叉點(diǎn)樣密度DNA長度摩爾比率雜交速率交叉雜交質(zhì)量控制適應(yīng)性寡核苷酸是無高固定均衡快低容易高cDNA否有低多樣多樣慢高困難低表2寡核苷酸與cDNA對比類別需要序列種類交叉點(diǎn)樣密度3.4點(diǎn)樣儀及點(diǎn)樣過程接觸式點(diǎn)樣非接觸式點(diǎn)樣3.4點(diǎn)樣儀及點(diǎn)樣過程接觸式點(diǎn)樣1.接觸式點(diǎn)樣

點(diǎn)樣針。

基本過程：

點(diǎn)樣針接觸探針溶液，通過浸潤現(xiàn)象或毛細(xì)現(xiàn)象，使液體轉(zhuǎn)移到針尖或針的狹縫中。針尖再接觸基片，樣品在基片上留下斑點(diǎn)，完成一次點(diǎn)樣。1.接觸式點(diǎn)樣點(diǎn)樣針的種類：

實(shí)心針（solidpin）裂隙針（splitpin）毛細(xì)管針（capillarytube）針與環(huán)（pinandring）點(diǎn)樣針的種類：bestbest圖3-13Amersham公司的MolecularDynamicsGenerationⅢArray點(diǎn)樣儀及毛細(xì)管點(diǎn)樣針圖3-13Amersham公司的MolecularDy2.非接觸式點(diǎn)樣（自學(xué)）（1）微螺線閥

（2）壓電元件2.非接觸式點(diǎn)樣（自學(xué)）基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件Cartesian-PixSysSeriesCartesian-PixSysSeries接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥1

1圖3-2當(dāng)前59家芯片設(shè)備生產(chǎn)商使用的點(diǎn)樣針分布情況（圖中的數(shù)字代表使用各點(diǎn)樣針的廠家數(shù)目）接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥11圖3-2當(dāng)前53.5

原位合成法3.5原位合成法操作平臺操作平臺Affymetrix芯片的特點(diǎn)：光導(dǎo)原位合成的寡核苷酸芯片高密度的點(diǎn)陣技術(shù)獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)

Affymetrix芯片的特點(diǎn)：1.光導(dǎo)原位合成原理1.光導(dǎo)原位合成原理2.高密度的點(diǎn)陣技術(shù)1個(gè)平方厘米的面積至少可排列幾十萬到一百多萬個(gè)探針合成區(qū)（“點(diǎn)”）2.高密度的點(diǎn)陣技術(shù)1個(gè)平方厘米的面積至少可排列幾十萬3.Affymetrix獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)3.Affymetrix獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)圖3-24PM-MM探針設(shè)計(jì)方案圖3-24PM-MM探針設(shè)計(jì)方案基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件高靈敏度圖3-26僅用PM探針與聯(lián)合應(yīng)用PM-MM探針檢測靶序列的靈敏度比較高靈敏度圖3-26僅用PM探針與聯(lián)合應(yīng)用PM-MM特異性和靈敏度的提高M(jìn)M探針的作用：內(nèi)參提高特異性背景信號提高靈敏度特異性和靈敏度的提高芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠圖3-25PM-MM的多個(gè)探針的結(jié)果與單個(gè)探針的結(jié)果比較芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠圖3-25PM-MM的多個(gè)探針的結(jié)果與單基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件圖3-27Affymetrix芯片的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（信號值的散點(diǎn)圖）圖3-27Affymetrix芯片的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（信號值的基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件4.光導(dǎo)原位合成法的缺點(diǎn)

需要避光掩膜，造價(jià)高；光脫保護(hù)方式，造成光衍射，制約探針密度的提高對研究者而言，每次實(shí)驗(yàn)只是使用芯片探針的一部分，探針浪費(fèi)嚴(yán)重4.光導(dǎo)原位合成法的缺點(diǎn)

需要避光掩膜，造價(jià)高；第三章基因芯片的制作方法第三章基因芯片的制作方法3.1概述

1.基因芯片是以Southern印跡雜交技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。

反向雜交技術(shù)3.1概述1.基因芯片是以Southern印跡雜2.基因芯片的制作方法：

原位合成法：Affymetrix公司

直接點(diǎn)樣法（合成后點(diǎn)樣）：Stanford大學(xué)，1995年2.基因芯片的制作方法：項(xiàng)目原位合成法直接點(diǎn)樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因組DNA，蛋白等探針長度約25nt不限制聯(lián)合合成需要不需要芯片表面點(diǎn)樣不需要需要密度高低制作成本高低應(yīng)用基因表達(dá)，突變檢測基因表達(dá)，突變檢測，CGH項(xiàng)目原位合成法直接點(diǎn)樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡1.常見的載體類型

膜

玻片

三維基質(zhì)包被玻片3.2芯片載體的制作1.常見的載體類型3.2芯片載體的制作（1）膜

優(yōu)點(diǎn)：與核酸親和力強(qiáng)。

缺點(diǎn)：單位面積上點(diǎn)樣密度低；

背景較高；

靈敏度低。（1）膜（2）玻片

優(yōu)點(diǎn)：耐受高溫和高離子強(qiáng)度；

具有不浸潤性，提高點(diǎn)樣密度；背景低。

缺點(diǎn)：二維的平面結(jié)構(gòu)，與DNA雜交時(shí)會有空間位阻。（2）玻片（3）三維基質(zhì)包被玻片

具有三維孔性結(jié)構(gòu)，更適合做蛋白質(zhì)芯片的支持物，可以保持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，不影響它的活性。（3）三維基質(zhì)包被玻片表1基因芯片不同載體性能對比載體類別陣列密度所需探針量檢測方法標(biāo)記膜低高放射性單色玻片高低多種彩色表1基因芯片不同載體性能對比載體類別陣列密度所需探針量檢測2.探針分子與基片表面的作用方式

化學(xué)偶聯(lián)：探針分子與基片表面活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成新的共價(jià)鍵。

物理吸附：探針分子與基片表面通過次級鍵相連接。2.探針分子與基片表面的作用方式3.玻片的修飾類型氨基修飾玻片同型雙功能偶聯(lián)劑修飾的玻片硫醇基修飾的玻片環(huán)氧硅烷化修飾的玻片等3.玻片的修飾類型圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片羥基氨基圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片對苯乙異硫氰酸（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基醛基戊二醛醛基圖3-6寡核苷酸探針固定在PDC基片上的原理連接分子手臂分子特異性探針圖3-6寡核苷酸探針固定在PDC基片上的原理連接分子手臂圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇基修飾的玻片硫醇基圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片環(huán)氧硅烷基圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片圖3-9在硅烷化玻片上生成樹形連接分子系統(tǒng)的示意（5）聚酰胺樹形連接分子系統(tǒng)修飾的玻片圖3-9在硅烷化玻片上生成樹形連接分子系統(tǒng)的示意（5）聚1.cDNA探針2.寡核苷酸探針3.基因組DNA探針（很少用）3.3探針的制備1.cDNA探針3.3探針的制備cDNA探針：

主要來自cDNA文庫，從細(xì)胞或組織中提取RNA后逆轉(zhuǎn)。cDNA探針：寡核苷酸探針：

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的基因序列人工合成的。

通常在5’末端進(jìn)行氨基修飾，并加入一段不直接參與雜交的重復(fù)序列，稱為手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特異性探針寡核苷酸探針：手臂分子特異性探針表2寡核苷酸與cDNA對比類別需要序列種類交叉點(diǎn)樣密度DNA長度摩爾比率雜交速率交叉雜交質(zhì)量控制適應(yīng)性寡核苷酸是無高固定均衡快低容易高cDNA否有低多樣多樣慢高困難低表2寡核苷酸與cDNA對比類別需要序列種類交叉點(diǎn)樣密度3.4點(diǎn)樣儀及點(diǎn)樣過程接觸式點(diǎn)樣非接觸式點(diǎn)樣3.4點(diǎn)樣儀及點(diǎn)樣過程接觸式點(diǎn)樣1.接觸式點(diǎn)樣

點(diǎn)樣針。

基本過程：

點(diǎn)樣針接觸探針溶液，通過浸潤現(xiàn)象或毛細(xì)現(xiàn)象，使液體轉(zhuǎn)移到針尖或針的狹縫中。針尖再接觸基片，樣品在基片上留下斑點(diǎn)，完成一次點(diǎn)樣。1.接觸式點(diǎn)樣點(diǎn)樣針的種類：

實(shí)心針（solidpin）裂隙針（splitpin）毛細(xì)管針（capillarytube）針與環(huán)（pinandring）點(diǎn)樣針的種類：bestbest圖3-13Amersham公司的MolecularDynamicsGenerationⅢArray點(diǎn)樣儀及毛細(xì)管點(diǎn)樣針圖3-13Amersham公司的MolecularDy2.非接觸式點(diǎn)樣（自學(xué)）（1）微螺線閥

（2）壓電元件2.非接觸式點(diǎn)樣（自學(xué)）基因芯片第三章基因芯片的制作方法課件Cartesian-PixSysSeriesCartesian-PixSysSeries接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥1

1圖3-2當(dāng)前59家芯片設(shè)備生產(chǎn)商使用的點(diǎn)樣針分布情況（圖中的數(shù)字代表使用各點(diǎn)樣針的廠家數(shù)目）接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥11圖3-2當(dāng)前53.5

原位合成法3.5原位合成法操作平臺操作平臺Affymetrix芯片的特點(diǎn)：光導(dǎo)原位合成的寡核苷酸芯片高密度的點(diǎn)陣技術(shù)獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)

Affymetrix芯片的特點(diǎn)：1.光導(dǎo)原位合