第一章基因工程

第一節(jié)基因工程概述角似鹿、鼻似獅、目似虎、唇似牛、爪似鷹、髭似馬、鱗似魚、身似蛇呼風(fēng)喚雨騰云駕霧定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。

限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶等工具酶、質(zhì)粒等載體和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，則直接促使了基因工程的誕生。

1973年:美\科恩：將兩種不同來源的ＤＮＡ分子進(jìn)行體外重組，并首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)，創(chuàng)立了定向改造生物的新技術(shù)——基因工程?；蚬こ痰恼Q生和發(fā)展大約經(jīng)歷了三個(gè)時(shí)期：1973～1976年為開始期；1977～1981年為發(fā)展期；1982年以后為迅猛發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用期。什么叫基因工程？

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。是指在體外，通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)并使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá),產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。（一）基因工程的概念概念的把握基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果特點(diǎn)本質(zhì)基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→

拼接→導(dǎo)入

→

表達(dá)打破種的界限，定向改造生物基因重組科恩和博耶的實(shí)驗(yàn)之后不久，有科學(xué)家將第一個(gè)真核生物——非洲爪蟾的基因?qū)氪竽c桿菌，使大腸桿菌產(chǎn)生非洲爪蟾的rRNA，這表明真核生物的基因可以在原核生物中得以表達(dá)。1977年美國科學(xué)家使生長激素抑制素基因在大腸桿菌中成功表達(dá)1978年，人胰島素在大腸桿菌中合成1979年，人生長激素基因在大腸桿菌中得以表達(dá)1980年，人干擾素基因在大腸桿菌成功表達(dá)1982年，美國科學(xué)家帕米特，采用顯微注射法得巨型小鼠解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？（二）DNA重組技術(shù)的基本工具

關(guān)鍵步驟一的工具：

關(guān)鍵步驟二的工具：

關(guān)鍵步驟三的工具：分子手術(shù)刀—限制性內(nèi)切酶分子針線—DNA連接酶

分子運(yùn)輸車—運(yùn)載體識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的2個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。4000種。

1、來源：

2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平口末端限制性核酸內(nèi)切酶T磷酸二酯鍵1234512345A大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶什么叫黏性末端？限制酶什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？什么叫平口末端？當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平口末端。

限制酶所識別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識別的序列，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。7中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ排列的。

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是原核生物的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會利用限制酶將外源DNA切割掉，使之失效，達(dá)到保證自身的安全的目的。限制酶在原核生物中的作用因?yàn)槲⑸镌陂L期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，對于外源入侵的DNA可以降解；含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。為什么細(xì)菌中限制酶不剪切本身的DNA？E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶DNA連接酶作用部位：磷酸二酯鍵DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。DNA連接酶區(qū)別：E·coliDNA連接酶

只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平口末端之間進(jìn)行連接T4DNA連接酶

既可“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平口末端，但連接平口末端之間的效率比較低DNA連接酶DNA聚合酶:是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接到正在合成的DNA單鏈中，形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體常用運(yùn)載體：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒質(zhì)粒：存在：主要存在于細(xì)菌的染色體以外。特性：是很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子，在細(xì)胞染色體外能夠自我復(fù)制。大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖作為運(yùn)載體的條件：（1）必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到運(yùn)載體上去。（2）必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。（3）必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組DNA分子的辨認(rèn)和篩選。（4）必需是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，也就是能夠安全地“借居”在受體細(xì)胞中。（5）分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。1.以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵C練習(xí)2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD3.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體BD再見1.目的基因的獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定（三）基因工程的一般過程與技術(shù)一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中獲取目的基因1.基因組文庫

將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。

受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。2.部分基因文庫

受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如cDNA文庫。基因文庫的構(gòu)建模式圖通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因DUCK179制作3.基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA反轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.原理

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）,它是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€(gè)過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。2.條件已知基因的核苷酸序列、4種脫氧核苷酸、一對引物、Taq酶（及緩沖溶液）3.過程高溫變性（90~95℃）低溫退火（55~60℃）中溫延伸（70~75℃）

雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個(gè)過程不需要解旋酶。多次重復(fù)4.特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子，即基因表達(dá)載體。質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種目的基因與運(yùn)載體結(jié)合①用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)有黏性末端的切口；②用同種限制酶切斷目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端；③將切下的目的基因片段，插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，使兩者結(jié)合成重組質(zhì)粒。以質(zhì)粒為載體，將目的基因與質(zhì)粒結(jié)合的步驟：（一）構(gòu)建目的

使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（二）構(gòu)建零件及其作用1.目的基因2.啟動(dòng)子

RNA聚合酶識別和結(jié)合的一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)。3.終止子一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。4.標(biāo)記基因鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來?；虮磉_(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。

基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑，且因受體細(xì)胞的不同而不同。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（感染雙子葉植物和裸子植物，對大多單子葉植物沒有感染力）基因槍法（常用于單子葉植物）花粉管通道法（轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)（“超級小鼠”）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞導(dǎo)入大腸桿菌方法：先用Ca2+處理，使其轉(zhuǎn)為感受態(tài)細(xì)胞。再將重組載體與感受態(tài)細(xì)胞混合。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）基因槍法（2）花粉管通道法從蘇云金芽苞桿菌中提取抗蟲基因從土壤農(nóng)桿菌中提取帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒同一種限制酶處理抗蟲基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌篩選將土壤農(nóng)桿菌與棉花細(xì)胞混合培養(yǎng)侵染重組質(zhì)粒將抗蟲基因?qū)朊藁?xì)胞并整合到棉花的DNA上植物組織培養(yǎng)獲得抗蟲棉抗蟲棉的培育流程圖：（二）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)含目的基因的表達(dá)載體動(dòng)物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動(dòng)物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯微注射分裂分化移植發(fā)育問題為什么將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的受體細(xì)胞是受精卵？（三）導(dǎo)入微生物細(xì)胞2.優(yōu)點(diǎn)

繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、操作簡單、價(jià)格低廉。3.常用受體細(xì)胞

大腸桿菌（E.coli）1.過程Ca2+處理法受體細(xì)胞：細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制不同種類的受體細(xì)胞1.對于植物而言，受體細(xì)胞可以是受精卵和體細(xì)胞2.對于動(dòng)物而言，受體細(xì)胞一般是受精卵。受精卵作為受體細(xì)胞具有體積、易操作、經(jīng)培養(yǎng)可直接表達(dá)性狀的優(yōu)點(diǎn)。3.微生物細(xì)胞作為受體具有繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少等優(yōu)點(diǎn)。四、目的基因的檢測與鑒定

目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢測、鑒定才能得知。

常用的檢測手段主要從分子水平和個(gè)體水平進(jìn)行。（一）分子水平1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因提取受體生物全部DNA適當(dāng)限制酶切割DNA片段用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術(shù)2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

提取受體生物的mRNA用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA）

檢測DNA利用的是DNA與DNA雜交，檢測mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。3.檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交技術(shù)提取受體生物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體雜交顯出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）（二）個(gè)體水平例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒