大腸桿菌基因工程—人胰島素的生產(chǎn)講述人599小組成員2016.11.7目錄1.利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽2.胰島素的生產(chǎn)方法3.產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽由于大腸桿菌繁殖迅速價(jià)格低廉，培養(yǎng)代謝易于控制，因此重組大腸桿菌在醫(yī)用蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。盡管有些生物活性嚴(yán)格依賴于糖基化作用的真核生物功能蛋白無法用重組大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，蛋白質(zhì)生物合成后加工系統(tǒng)的缺乏使得某些人體蛋白難以折成天然構(gòu)象，但仍有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、尿激酶原（pro-UK）、金屬硫蛋白（MT）、二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的二聚體蛋白巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）以及四聚體的血紅蛋白(Hb）等。本次以重組人胰島素為例，論述利用大腸桿菌生產(chǎn)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的基本過程。產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略1

A鏈和B鏈的編碼區(qū)由化學(xué)合成，兩個(gè)雙鏈DNA片段分別克隆在含有Ptac啟動(dòng)子和β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)型質(zhì)粒上，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因，其連接位點(diǎn)處為甲硫氨酸密碼子。重組分子分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞，兩種克隆菌分別合成β-半乳糖苷酶-人胰島素A鏈以及β-半乳糖苷酶-人胰島素B鏈兩種融合蛋白。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白，再用溴化氫在甲硫氨酸殘基的C端化學(xué)切斷融合蛋白，釋放出人胰島素的A鏈和B鏈。胰島素AB鏈分別表達(dá)法的基本原理AB鏈分別表達(dá)法2人胰島素原表達(dá)法雖然上述工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)更為簡捷，而且需要額外使用兩種高純度的酶制劑，但由于其體外折疊成功率相當(dāng)高，在一定程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得產(chǎn)品的生產(chǎn)成本僅為50美元/g。

將人胰島素原cDNA編碼序列克隆在β-半乳糖苷酶基因下游，兩個(gè)DNA片段的連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表達(dá)后，分離純化融合蛋白，并同樣采取溴化氫化學(xué)裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進(jìn)行體外折疊。由于C肽的存在，胰島素原在復(fù)性條件下能形成天然的空間構(gòu)象，為3對二硫鍵的正確配對提供了良好的條件，使得體外折疊率高達(dá)80%以上。為了獲得具有生物活性的胰島素，經(jīng)折疊后的人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C肽，可獲得完整的A鏈以及C端帶有精氨酸Arg的B鏈。AB鏈同時(shí)表達(dá)法

這種方法的基本思路是將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)溴化氫CNBr處理后，分離傳話A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸性質(zhì)，采用相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外折疊制備具有活性的重組人胰