《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：指的是從動(dòng)物組織或細(xì)胞從體內(nèi)取出，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)：

培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：指的是從動(dòng)物組織或細(xì)胞從體內(nèi)取出，在模擬第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)〔一〕動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)①動(dòng)物細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁②動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間長(zhǎng)，易受污染③需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感④動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在⑤原代細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生培養(yǎng)細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：①失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)；②分化減弱或不顯、出現(xiàn)類似“反祖”

現(xiàn)象；③表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。（二）體內(nèi)外細(xì)胞的差異培養(yǎng)細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：（二）體內(nèi)外細(xì)胞的差異二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（一）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分類體外細(xì)胞生長(zhǎng)貼附型懸浮型多形型細(xì)胞（神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，呈多角形）上皮細(xì)胞型（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源于外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞）成纖維細(xì)胞型（心肌、平滑肌、血管內(nèi)皮等，源于中胚層細(xì)胞）游走細(xì)胞型（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，形狀不定）（生長(zhǎng)時(shí)不貼壁，如淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞）二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（一）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分類體外細(xì)胞生長(zhǎng)貼《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)體外細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)貼壁接觸抑制密度抑制（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)體外細(xì)胞貼壁1）細(xì)胞貼壁過(guò)程1）細(xì)胞貼壁過(guò)程2）接觸抑制定義：細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。2）接觸抑制定義：細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)3）密度抑制細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，數(shù)量仍在增多，但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大時(shí)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分的減少，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。3）密度抑制細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期細(xì)胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期。培養(yǎng)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程與體內(nèi)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程相似。三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期細(xì)胞周期可分為G1體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程原代培養(yǎng)期:從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個(gè)階段，一般持續(xù)1-4周。這個(gè)階段細(xì)胞比較活潑，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。傳代期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱細(xì)胞系。細(xì)胞增殖旺盛，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖緩慢，以致完全停頓。衰退期：細(xì)胞增殖緩慢或不增殖。細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程原代培養(yǎng)期:從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cel《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件3．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。核型大多變成異倍體。3．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，增殖很慢或不增殖，最后（二）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一代指的是從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。在細(xì)胞一代中細(xì)胞倍增3～6次。時(shí)期：潛伏期；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；穩(wěn)定（停滯）期；衰亡期。每代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（二）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一代指的是從細(xì)胞接種到每代細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期細(xì)胞接種后，先進(jìn)入生長(zhǎng)緩慢的滯留階段，胞體均呈圓球形懸浮于培養(yǎng)液中，接著細(xì)胞開(kāi)始附著于支持物表面。細(xì)胞貼壁后，逐漸伸展，恢復(fù)細(xì)胞原有形態(tài)，經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏期，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。

又稱對(duì)數(shù)期。此期為細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，成倍增長(zhǎng)，活力最佳。

又稱平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量飽和，細(xì)胞不再增殖，但仍有代謝活動(dòng)。

每代細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期細(xì)胞接種后，先進(jìn)入生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程：取材、培養(yǎng)及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程：取材、培養(yǎng)及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。第二節(jié)動(dòng)物一、細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)（一）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是將動(dòng)物的各種組織從機(jī)體取出，經(jīng)酶(常用胰蛋白酶)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和繁殖。

一、細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)（一）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是將動(dòng)物的各種鼠胚組織取材1.原代細(xì)胞的取材鼠胚組織取材1.原代細(xì)胞的取材鼠腎（或肺）取材鼠腎（或肺）取材組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。1）懸浮細(xì)胞的分離方法2.原代細(xì)胞的分離組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)消化分離法2）實(shí)體組織材料的分離方法機(jī)械分散法（物理裂解）方法消化分離法2）實(shí)體組織材料的分離方法機(jī)械分散法方法特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。機(jī)械分散法特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適胰蛋白酶分散原理：主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解而使細(xì)胞分散開(kāi)。酶消化分離法胰蛋白酶膠原酶胰蛋白酶消化分離法胰蛋白酶分散原理：主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件1）組織塊培養(yǎng)法3.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法1）組織塊培養(yǎng)法3.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和（二）傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞消化法傳代直接吹打或用硅膠軟刮懸浮細(xì)胞直接吹打自然沉降法傳代培養(yǎng)方法（二）傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞消化法傳代懸浮細(xì)胞直接吹打傳代（1）貼壁細(xì)胞的消化傳代方法（1）貼壁細(xì)胞的消化傳代方法（2）懸浮細(xì)胞傳代方法直接傳代讓?xiě)腋〖?xì)胞自然沉降棄掉1/2-1/3上清用吸管輕輕吹打制備成細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)離心法傳代將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中離心收集細(xì)胞棄去上清加新的培養(yǎng)液吸管吹打制備成細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)（2）懸浮細(xì)胞傳代方法直接傳代讓?xiě)腋〖?xì)胞自然沉降棄掉1/2體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物的胚胎組織，體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng)，來(lái)源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng)，既有上皮樣細(xì)胞又有纖維樣細(xì)胞，混雜的細(xì)胞會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（三）細(xì)胞純化

體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物的胚胎組織，體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng)1.自然純化

自然純化是利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺盛的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及研究目的來(lái)選擇細(xì)胞。此法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，留下的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過(guò)此方法而保留下來(lái)的，不斷純化而建立細(xì)胞系。

1.自然純化

2.人工純化人工純化是利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。（1）酶消化法

酶消化法是比較常用的純化方法，對(duì)貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞先脫壁。2.人工純化（1）酶消化法

酶消化法是比較常用的純化方法，（2）機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為區(qū)成混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上?？捎霉柘鹉z刮子去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域。這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。

（2）機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為（3）反復(fù)貼壁法

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10-30min）完成附著過(guò)程。上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。

（3）反復(fù)貼壁法

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。目前，動(dòng)物細(xì)胞一般保存于液氮中（-196℃）。一般在原代或傳代2-10次內(nèi)即大量?jī)龃?，作為原種。（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力在細(xì)胞凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。原理：1.常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)。2.提高胞膜對(duì)水的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。原理：凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶。凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：-196℃液氮罐普通冰箱低溫冰箱-196℃液氮罐普通冰箱低溫冰箱解凍程序原則：快速解凍原因：解凍緩慢時(shí)，原有冰晶溶化后，又會(huì)以新的晶核為中心形成更大的冰晶，稱為水的重結(jié)晶現(xiàn)象。但采用快速解凍可避免水分的重結(jié)晶減少冰晶損傷。解凍程序：從液氮中取出冷凍管，快速放入37℃-

40℃水浴中，輕輕震搖，使凍存細(xì)胞盡快解凍（40-60s).

解凍程序原則：快速解凍《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法懸滴培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法細(xì)胞同步化培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)常用的培養(yǎng)技術(shù)二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法懸滴培養(yǎng)常用的培養(yǎng)技術(shù)單蓋玻片①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開(kāi)②將待培養(yǎng)的組織塊鋪展于培養(yǎng)液中央③將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封④貼壁24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞就能從組織塊四周游走（一）懸滴培養(yǎng)法單蓋玻片①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開(kāi)②將待培養(yǎng)的組織塊鋪（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法組織塊的接種與培養(yǎng)分離細(xì)胞的接種與培養(yǎng)（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法組織塊的接種與培養(yǎng)分離細(xì)胞的接種與培養(yǎng)（三）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法由于旋轉(zhuǎn)作用，組織塊和細(xì)胞交替地與培養(yǎng)基和空氣直接接觸。（三）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法由于旋轉(zhuǎn)作用，組織塊和細(xì)胞交替地與培養(yǎng)基（四）克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。（四）克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，將從細(xì)胞懸（五）灌注小室培養(yǎng)法（五）灌注小室培養(yǎng)法（六）培養(yǎng)板培養(yǎng)法

具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。

（六）培養(yǎng)板培養(yǎng)法

具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法１．轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法１．轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)２．反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不會(huì)隨攪拌而隨培養(yǎng)液一起流動(dòng)，比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離和培養(yǎng)設(shè)備。２．反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不會(huì)隨攪拌而隨培將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液\過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。３．懸浮培養(yǎng)將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液\過(guò)濾、離心、純化、漂洗４．固定化培養(yǎng)１）微載體法微載體是直徑60-250um的微珠。一般有天然的葡聚糖或者合成的聚合物組成，如聚苯乙烯微載體、聚甲基丙稀酸羥乙酯微載體等。擴(kuò)大細(xì)胞附著面，提高生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量。（1）微載體培養(yǎng)系統(tǒng)４．固定化培養(yǎng)１）微載體法微載體是直徑60-250um的微珠《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件２〕多孔載體法多用明膠制成。優(yōu)點(diǎn)：降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長(zhǎng)空間，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化培養(yǎng)。２〕多孔載體法多用明膠制成?！玻病持锌绽w維培養(yǎng)系統(tǒng)最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，外表有許多海綿狀多孔構(gòu)造。這樣，水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過(guò)，細(xì)胞也可在上面貼附生長(zhǎng)?！玻病持锌绽w維培養(yǎng)系統(tǒng)最初使用的空心纖維是一種由〔３〕微囊培養(yǎng)系統(tǒng)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可自由透過(guò)，大分子物質(zhì)可包裹在其中不能逸出。微囊化培養(yǎng)是將細(xì)胞包裹在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，減少了攪拌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力。細(xì)胞懸浮于海藻酸鈉溶液中，滴入氯化鈣溶液，再用聚-L-賴氨酸和聚乙烯胺溶液處理，形成半透膜?！玻场澄⒛遗囵B(yǎng)系統(tǒng)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件按培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，反應(yīng)器可分為以下三類：

1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；

2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器；3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器。

（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類按培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，反應(yīng)器可分為以下三類：

1.懸浮培一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立（一）細(xì)胞形態(tài)觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立（一）細(xì)胞形態(tài)觀細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)所做出的曲線。（二）細(xì)胞生長(zhǎng)情況1.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，以（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，用以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的一種方法。（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)?！馦TT比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能?！穸讈嗧磕苋芙獬练e在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍(lán)紫色產(chǎn)物量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。(2)MTT比色法●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，四唑鹽（MTT）商品名MTT法+DMSOMTT法+DMSO操作步驟：接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（103-104細(xì)胞200微升/孔）37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔）振蕩10分鐘酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線操作步驟：接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（103-104細(xì)胞200微(3)CCK-8法（CellCountingKit-8）原理：試劑中含有WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體【1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲脂】(1-MethoxyPMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料。甲瓚染料的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此可以根據(jù)測(cè)定吸光度值來(lái)測(cè)定增值細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。(3)CCK-8法（CellCountingKit-8《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件96孔板接種培養(yǎng)一定時(shí)間的細(xì)胞（100μl/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)加CCK-810μl/孔測(cè)吸光度CCK-8法96孔板接種培養(yǎng)一定時(shí)間的細(xì)胞（100μl/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2

96孔板比色分析

為1瓶溶液，即開(kāi)即用

對(duì)細(xì)胞毒性小毋需有機(jī)溶劑靈敏度高CellCountingKit-8優(yōu)點(diǎn)96孔板比色分析CellCountingKit-8優(yōu)點(diǎn)2.細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占的百分率，用以表示細(xì)胞的增殖旺盛程度。一般計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂指數(shù)。公式：2.細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占3.

細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長(zhǎng)細(xì)胞，主要反映細(xì)胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。3.細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生4.細(xì)胞周期細(xì)胞周期是指一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成的細(xì)胞至下一次再分裂結(jié)束形成兩個(gè)子細(xì)胞的時(shí)間，僅指一個(gè)細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)周期時(shí)間。4.細(xì)胞周期細(xì)胞周期是指一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成的細(xì)胞至下5.細(xì)胞活力檢測(cè)由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排除，因而細(xì)胞顯示一定的顏色。而活細(xì)胞由于能排除進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，故不易著色。5.細(xì)胞活力檢測(cè)由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞（不著色）和死細(xì)胞（染上藍(lán)色）數(shù)目。計(jì)算活細(xì)胞百分比。trypanblue臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)trypanblue溴化乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法溴化乙錠（EB）和碘化丙錠（PI）均為熒光染料，可與DNA特異結(jié)合。

Photomicrographs

EthidiumBromide熒光染色與計(jì)數(shù)：取細(xì)胞懸液和EB或PI染液各0.5ml，混勻。靜置10～30min后于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。發(fā)橙紅色熒光者為死細(xì)胞。溴化乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法Photomicrographs二、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查（一）培養(yǎng)液和pH鑒定（二）細(xì)胞生長(zhǎng)情況分析（三）培養(yǎng)細(xì)胞的污染監(jiān)測(cè)和排除二、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查（一）培養(yǎng)液和pH鑒定培養(yǎng)細(xì)胞污染微生物真菌細(xì)菌支原體病毒化學(xué)物質(zhì)（非細(xì)胞生長(zhǎng)所需化學(xué)成分）細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）培養(yǎng)細(xì)胞污染微生物真菌化學(xué)物質(zhì)（非細(xì)胞生長(zhǎng)所需化學(xué)成分）細(xì)胞常見(jiàn)的污染及檢測(cè)方法(1)細(xì)菌的污染及檢測(cè)常見(jiàn)細(xì)菌污染革蘭氏陰性菌（白色葡萄菌）E.coli假單胞菌檢測(cè)方法顯微鏡觀察法（在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染）肉眼直接觀察法（培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起）培養(yǎng)檢查法（采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，若被污染24小時(shí)內(nèi)可獲得陽(yáng)性結(jié)果）常見(jiàn)的污染及檢測(cè)方法(1)細(xì)菌的污染及檢測(cè)常見(jiàn)細(xì)菌污染革蘭氏(2)真菌的污染及檢測(cè)常見(jiàn)真菌污染檢測(cè)方法煙曲菌、黑曲菌毛霉菌、孢子菌白念球菌、酵母菌肉眼直接觀察法（培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起）顯微鏡觀察法（在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染

）(2)真菌的污染及檢測(cè)常見(jiàn)真菌污染檢測(cè)方法煙曲菌、黑曲菌肉眼fungusfungus中間長(zhǎng)梭型的是正在分裂的念珠菌真菌污染中間長(zhǎng)梭型的是正在分裂的念珠菌真菌污染(3)支原體污染及檢測(cè)支原體是介于細(xì)菌與病毒之間的一種能夠獨(dú)立生活的最小的微生物，最小直徑在0.2μm之間，無(wú)細(xì)胞壁，可呈現(xiàn)多形性。支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)而又難以解決的問(wèn)題。(3)支原體污染及檢測(cè)支原體是介于細(xì)菌與病毒之間的一種能夠獨(dú)支原體污染的檢測(cè)方法支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。①相差顯微鏡觀察MycoplasmaInfections

支原體污染的檢測(cè)方法支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞②熒光染色法觀察

用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。支原體污染細(xì)胞的Hoechst33258染色結(jié)果②熒光染色法觀察用熒光染料Hoechst33258，此染③電鏡檢測(cè)用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。

掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體③電鏡檢測(cè)用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～支原體污染電鏡照片(X30k),煎蛋狀和其他形狀將細(xì)胞懸液加入支原體肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。④培養(yǎng)檢測(cè)支原體污染電鏡照片(X30k),煎蛋狀和其他形狀將細(xì)胞懸液思考題1.簡(jiǎn)述培養(yǎng)細(xì)胞的生命期。2.簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法。

思考題1.簡(jiǎn)述培養(yǎng)細(xì)胞的生命期?！秳?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：指的是從動(dòng)物組織或細(xì)胞從體內(nèi)取出，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)：

培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：指的是從動(dòng)物組織或細(xì)胞從體內(nèi)取出，在模擬第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)〔一〕動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)①動(dòng)物細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁②動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間長(zhǎng)，易受污染③需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感④動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在⑤原代細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生培養(yǎng)細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：①失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)；②分化減弱或不顯、出現(xiàn)類似“反祖”

現(xiàn)象；③表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。（二）體內(nèi)外細(xì)胞的差異培養(yǎng)細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：（二）體內(nèi)外細(xì)胞的差異二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（一）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分類體外細(xì)胞生長(zhǎng)貼附型懸浮型多形型細(xì)胞（神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，呈多角形）上皮細(xì)胞型（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源于外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞）成纖維細(xì)胞型（心肌、平滑肌、血管內(nèi)皮等，源于中胚層細(xì)胞）游走細(xì)胞型（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，形狀不定）（生長(zhǎng)時(shí)不貼壁，如淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞）二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（一）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分類體外細(xì)胞生長(zhǎng)貼《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)體外細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)貼壁接觸抑制密度抑制（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)體外細(xì)胞貼壁1）細(xì)胞貼壁過(guò)程1）細(xì)胞貼壁過(guò)程2）接觸抑制定義：細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。2）接觸抑制定義：細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)3）密度抑制細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，數(shù)量仍在增多，但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大時(shí)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分的減少，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。3）密度抑制細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期細(xì)胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期。培養(yǎng)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程與體內(nèi)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程相似。三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期細(xì)胞周期可分為G1體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程原代培養(yǎng)期:從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個(gè)階段，一般持續(xù)1-4周。這個(gè)階段細(xì)胞比較活潑，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。傳代期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱細(xì)胞系。細(xì)胞增殖旺盛，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖緩慢，以致完全停頓。衰退期：細(xì)胞增殖緩慢或不增殖。細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程原代培養(yǎng)期:從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cel《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件3．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。核型大多變成異倍體。3．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，增殖很慢或不增殖，最后（二）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一代指的是從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。在細(xì)胞一代中細(xì)胞倍增3～6次。時(shí)期：潛伏期；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；穩(wěn)定（停滯）期；衰亡期。每代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（二）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一代指的是從細(xì)胞接種到每代細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期細(xì)胞接種后，先進(jìn)入生長(zhǎng)緩慢的滯留階段，胞體均呈圓球形懸浮于培養(yǎng)液中，接著細(xì)胞開(kāi)始附著于支持物表面。細(xì)胞貼壁后，逐漸伸展，恢復(fù)細(xì)胞原有形態(tài)，經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏期，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。

又稱對(duì)數(shù)期。此期為細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，成倍增長(zhǎng)，活力最佳。

又稱平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量飽和，細(xì)胞不再增殖，但仍有代謝活動(dòng)。

每代細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期細(xì)胞接種后，先進(jìn)入生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程：取材、培養(yǎng)及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程：取材、培養(yǎng)及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。第二節(jié)動(dòng)物一、細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)（一）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是將動(dòng)物的各種組織從機(jī)體取出，經(jīng)酶(常用胰蛋白酶)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和繁殖。

一、細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)（一）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是將動(dòng)物的各種鼠胚組織取材1.原代細(xì)胞的取材鼠胚組織取材1.原代細(xì)胞的取材鼠腎（或肺）取材鼠腎（或肺）取材組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。1）懸浮細(xì)胞的分離方法2.原代細(xì)胞的分離組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)消化分離法2）實(shí)體組織材料的分離方法機(jī)械分散法（物理裂解）方法消化分離法2）實(shí)體組織材料的分離方法機(jī)械分散法方法特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。機(jī)械分散法特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適胰蛋白酶分散原理：主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解而使細(xì)胞分散開(kāi)。酶消化分離法胰蛋白酶膠原酶胰蛋白酶消化分離法胰蛋白酶分散原理：主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件1）組織塊培養(yǎng)法3.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法1）組織塊培養(yǎng)法3.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和（二）傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞消化法傳代直接吹打或用硅膠軟刮懸浮細(xì)胞直接吹打自然沉降法傳代培養(yǎng)方法（二）傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞消化法傳代懸浮細(xì)胞直接吹打傳代（1）貼壁細(xì)胞的消化傳代方法（1）貼壁細(xì)胞的消化傳代方法（2）懸浮細(xì)胞傳代方法直接傳代讓?xiě)腋〖?xì)胞自然沉降棄掉1/2-1/3上清用吸管輕輕吹打制備成細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)離心法傳代將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中離心收集細(xì)胞棄去上清加新的培養(yǎng)液吸管吹打制備成細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)（2）懸浮細(xì)胞傳代方法直接傳代讓?xiě)腋〖?xì)胞自然沉降棄掉1/2體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物的胚胎組織，體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng)，來(lái)源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng)，既有上皮樣細(xì)胞又有纖維樣細(xì)胞，混雜的細(xì)胞會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（三）細(xì)胞純化

體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物的胚胎組織，體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng)1.自然純化

自然純化是利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺盛的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及研究目的來(lái)選擇細(xì)胞。此法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，留下的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過(guò)此方法而保留下來(lái)的，不斷純化而建立細(xì)胞系。

1.自然純化

2.人工純化人工純化是利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。（1）酶消化法

酶消化法是比較常用的純化方法，對(duì)貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞先脫壁。2.人工純化（1）酶消化法

酶消化法是比較常用的純化方法，（2）機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為區(qū)成混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上?？捎霉柘鹉z刮子去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域。這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。

（2）機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為（3）反復(fù)貼壁法

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10-30min）完成附著過(guò)程。上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。

（3）反復(fù)貼壁法

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。目前，動(dòng)物細(xì)胞一般保存于液氮中（-196℃）。一般在原代或傳代2-10次內(nèi)即大量?jī)龃妫鳛樵N。（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力在細(xì)胞凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。原理：1.常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)。2.提高胞膜對(duì)水的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。原理：凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶。凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：-196℃液氮罐普通冰箱低溫冰箱-196℃液氮罐普通冰箱低溫冰箱解凍程序原則：快速解凍原因：解凍緩慢時(shí)，原有冰晶溶化后，又會(huì)以新的晶核為中心形成更大的冰晶，稱為水的重結(jié)晶現(xiàn)象。但采用快速解凍可避免水分的重結(jié)晶減少冰晶損傷。解凍程序：從液氮中取出冷凍管，快速放入37℃-

40℃水浴中，輕輕震搖，使凍存細(xì)胞盡快解凍（40-60s).

解凍程序原則：快速解凍《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法懸滴培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法細(xì)胞同步化培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)常用的培養(yǎng)技術(shù)二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法懸滴培養(yǎng)常用的培養(yǎng)技術(shù)單蓋玻片①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開(kāi)②將待培養(yǎng)的組織塊鋪展于培養(yǎng)液中央③將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封④貼壁24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞就能從組織塊四周游走（一）懸滴培養(yǎng)法單蓋玻片①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開(kāi)②將待培養(yǎng)的組織塊鋪（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法組織塊的接種與培養(yǎng)分離細(xì)胞的接種與培養(yǎng)（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法組織塊的接種與培養(yǎng)分離細(xì)胞的接種與培養(yǎng)（三）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法由于旋轉(zhuǎn)作用，組織塊和細(xì)胞交替地與培養(yǎng)基和空氣直接接觸。（三）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法由于旋轉(zhuǎn)作用，組織塊和細(xì)胞交替地與培養(yǎng)基（四）克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。（四）克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，將從細(xì)胞懸（五）灌注小室培養(yǎng)法（五）灌注小室培養(yǎng)法（六）培養(yǎng)板培養(yǎng)法

具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。

（六）培養(yǎng)板培養(yǎng)法

具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法１．轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法１．轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)２．反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不會(huì)隨攪拌而隨培養(yǎng)液一起流動(dòng)，比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離和培養(yǎng)設(shè)備。２．反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不會(huì)隨攪拌而隨培將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液\過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。３．懸浮培養(yǎng)將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液\過(guò)濾、離心、純化、漂洗４．固定化培養(yǎng)１）微載體法微載體是直徑60-250um的微珠。一般有天然的葡聚糖或者合成的聚合物組成，如聚苯乙烯微載體、聚甲基丙稀酸羥乙酯微載體等。擴(kuò)大細(xì)胞附著面，提高生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量。（1）微載體培養(yǎng)系統(tǒng)４．固定化培養(yǎng)１）微載體法微載體是直徑60-250um的微珠《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件２〕多孔載體法多用明膠制成。優(yōu)點(diǎn)：降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長(zhǎng)空間，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化培養(yǎng)。２〕多孔載體法多用明膠制成?！玻病持锌绽w維培養(yǎng)系統(tǒng)最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，外表有許多海綿狀多孔構(gòu)造。這樣，水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過(guò)，細(xì)胞也可在上面貼附生長(zhǎng)?！玻病持锌绽w維培養(yǎng)系統(tǒng)最初使用的空心纖維是一種由〔３〕微囊培養(yǎng)系統(tǒng)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可自由透過(guò)，大分子物質(zhì)可包裹在其中不能逸出。微囊化培養(yǎng)是將細(xì)胞包裹在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，減少了攪拌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力。細(xì)胞懸浮于海藻酸鈉溶液中，滴入氯化鈣溶液，再用聚-L-賴氨酸和聚乙烯胺溶液處理，形成半透膜。〔３〕微囊培養(yǎng)系統(tǒng)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件按培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，反應(yīng)器可分為以下三類：

1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；

2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器；3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器。

（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類按培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，反應(yīng)器可分為以下三類：

1.懸浮培一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立（一）細(xì)胞形態(tài)觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立（一）細(xì)胞形態(tài)觀細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)所做出的曲線。（二）細(xì)胞生長(zhǎng)情況1.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，以（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，用以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的一種方法。（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)?！馦TT比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能?！穸讈嗧磕苋芙獬练e在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍(lán)紫色產(chǎn)物量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。(2)MTT比色法●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，四唑鹽（MTT）商品名MTT法+DMSOMTT法+DMSO操作步驟：接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（103-104細(xì)胞200微升/孔）37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔）振蕩10分鐘酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線操作步驟：接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（103-104細(xì)胞200微(3)CCK-8法（CellCountingKit-8）原理：試劑中含有WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體【1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲脂】(1-MethoxyPMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料。甲瓚染料的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此可以根據(jù)測(cè)定吸光度值來(lái)測(cè)定增值細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。(3)CCK-8法（CellCountingKit-8《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件96孔板接種培養(yǎng)一定時(shí)間的細(xì)胞（100μl/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)加CCK-810μl/孔測(cè)吸光度CCK-8法96孔板接種培養(yǎng)一定時(shí)間的細(xì)胞（100μl/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2

96孔板比色分析

為1瓶溶液，即開(kāi)即用

對(duì)細(xì)胞毒性小毋需有機(jī)溶劑靈敏度高CellCountingKit-8優(yōu)點(diǎn)96孔板比色分析CellCountingKit-8優(yōu)點(diǎn)2.細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中