3基因工程工具酶

Instrumentalenzymeofgeneengineering掌握：工具酶的特性和用途

1.限制性核酸內(nèi)切酶2.DNA連接酶3.DNA聚合酶4.DNA修飾酶重點：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶特性和用途難點：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶特性和用途

應用于基因工程的各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標記探針、載體構(gòu)建、目的基因選取、重組的、DNA制備等程序中所需要的酶類。主要是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，末端轉(zhuǎn)移酶、單鏈核酸酶和反轉(zhuǎn)錄酶。

所以把這些酶稱為“基因工程工具酶”。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。3.1限制性核酸內(nèi)切酶

①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)發(fā)現(xiàn)細菌的“限制”現(xiàn)象：Phageλ（k）感染E.colik不感染E.coliB(E.coliB限制

λ（k）)

②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB對λ(K)DNA進行了修飾。E.coliB修飾λ(k)*感染E.coli(B)-λ

細菌如何對λ噬菌體進行限制和修飾?3.1.1細菌的限制-修飾系統(tǒng)細菌的限制—修飾系統(tǒng)

①1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在Phageλ的DNA上。

②1965年，Arber發(fā)現(xiàn)修飾與λ的降解有關(guān)，提出：細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。

限制—修飾的酶學假說(B)(B)酶切位點不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點被修飾Methylation基因組DNA不被切割識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵限制性核酸內(nèi)切酶1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。1978年，W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金。截止到目前為止，已經(jīng)分離出400余種II類酶，搞清識別位點的有300種，商品化的約有100種，而實驗室常用的有20種。限限制性核核酸內(nèi)切切酶的分分類1.限限制修飾飾活性2.內(nèi)內(nèi)切酶的的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限限制輔助助因子4.切切割位點點5.特特異性切切割6.基基因克隆隆中I型型單一多功功能的酶酶3種不同同亞基ATP、、Mg2+和S-腺腺苷甲硫硫氨酸距特異性性位點1000bp不是無用II型型限制酶和和修飾酶酶分開單一成分分Mg2+特異性位位點及其其附近是非常有用用III型型雙功能酶酶2種亞基基ATP、、Mg2+和S-腺腺苷甲硫硫氨酸特異性位位點3‘‘端24-26bp處處是有用型型限制性性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的的特點1、識別別位點的的特異性性:每種種酶都有有其特定定的DNA識別別位點，，通常是是由4～8個核苷酸酸組成的的特定序序列（靶序列列）例如：HindⅡ5’’-GTPyPuAC–3’MboⅠ5’’-GATC––3’GANC2、識別別序列的的對稱性性:靶序序列通常常具有雙雙重旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)對稱的的結(jié)構(gòu)，，即雙鏈鏈的核苷苷酸順序序呈回文結(jié)構(gòu)構(gòu)。3、切割割位點的的規(guī)范性性:雙鏈DNA被酶酶切后，，分布在在兩條鏈鏈上的切割位點點旋轉(zhuǎn)對對稱（可形成成粘性末末端或平平末端的的DNA分子））。4、識別別序列中中的堿基基被甲基基化修飾飾后會影影響部分分酶的切切割作用用效果。。3.1.4限制性性內(nèi)切酶的的切割方式式限制性核酸酸內(nèi)切酶－－“分子手手術(shù)刀”“切哪里””?磷酸二酯鍵鍵ATGCATGC脫氧核苷酸酸鏈磷酸二酯鍵鍵基因的剪刀刀——限制制性內(nèi)切酶酶（簡稱限限制酶）怎樣切？例：大腸桿桿菌(E.coli)的一種種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。。限制酶限制酶幾種II型型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的酶切位位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

什么叫黏性性末端？被限制酶切切開的DNA兩條單單鏈的切口口，帶有幾幾個伸出的核苷苷酸，它們之間間正好互補配對，這樣的切切口叫黏性末端。3’粘性末末端；5’’粘性末端端5’3’練一練CB5、原核6、、核苷酸7、磷磷酸二酯鍵鍵8、黏性末末端9、平末端端3.1.5限制性性核酸內(nèi)切切酶的命名名-1973Smith和Nathams1、寄主菌屬名名的第一個字字母和種名名的頭兩個個字母組成成3個斜體字母的略語語表示酶來來源的菌種種名稱，如如大腸桿菌菌Escherichiacoli表示為Eco,流感嗜嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示為Hin；2、用1個正體字母表示菌株的類型，比比如EcoR、Hind，若酶存存在于質(zhì)粒上上，則需大大寫字母表表示非染色色體遺傳因因子；3、該菌株株（種）中中發(fā)現(xiàn)的不不同的酶按按照順序以以羅馬字母母編號I,II,III等。。3.1.6同裂酶酶和同尾酶酶同裂酶（isoschizomer）：是指指來源不同同的但卻具具有相同的識別別序列，切割DNA后產(chǎn)生相同末末端（或不不同末端））的一組限制制酶。KpnI5’……GGTACC………3’Asp7185’……GGTACC………3’XmaI5’……CCCGGG……3’SmaI5’……CCCGGG……3’同序同切同序異切同尾酶（isocaudamer））：是指來來源不同、、識別序序列也也不同同但切割割后產(chǎn)產(chǎn)生相同的的粘性性末端端一類限限制酶酶。經(jīng)同尾尾酶消消化的的DNA末末端連連接示示意圖圖5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’’BglII5’XXXXAGATCTXXXXXX3’’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII限限制性性內(nèi)切切酶識識別序序列出出現(xiàn)的的幾率率及酶酶切片片段的的估算算影影響限限制性性內(nèi)切切酶活活性的的因素素DNA純純度度DNA的的甲甲基基化化程程度度DNA的的分分子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的緩緩沖沖液液酶切消化反應應的時間和溫溫度反應體積和甘甘油濃度一個酶單位（（U）指：在在理想的反應應條件（適宜宜的緩沖液和和反應溫度，，通常為37℃）下，1min內(nèi)引引起1μmol底物發(fā)生生反應的酶量。酶單位的定義義和影響酶活活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L酶切反應的基基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT酶量的確定：：2-3倍才才能保證完全全消化；DNA識別位點的密密度有關(guān)酶切操作注意意事項選擇正確的酶酶DNA的純度度和濃度反應體系甘油油的量<5%（酶保存在在50％甘油油中，故所加加酶液體積最最多為酶切反反應總體積的的1/10））。酶保存在-200C；使用時在在冰浴上操作。反應體系各成成分都加完后后，最后加酶。每次取酶液用用新的槍頭，，防止交叉污污染。防止任何可能能引起酶蛋白白變性的因素素，如：氣泡泡、去污劑星活性（staractivity）指限制性內(nèi)切切酶在非標準條件件下，對與識別序序列相似的其其它序列也進進行切割反應應，導致出現(xiàn)現(xiàn)非特異性的的DNA片段段的現(xiàn)象。易產(chǎn)生星活性性的內(nèi)切酶用用*標記。如如：EcoRI*造成星活性參參數(shù)甘油濃度12-20%，，酶與DNA比例，離子子強度，45%聚乙二醇醇(PEG)，有機溶劑劑，8%二甲甲基亞楓，二二價陽離子，，12%乙醇醇。限制性內(nèi)切酶酶的應用1、重組DNA前的切割割2、構(gòu)建新質(zhì)質(zhì)粒3、構(gòu)建物理理圖譜4、DNA分分子雜交5、制備DNA探針6、亞克隆以以用作序列分分析7、基因定位位，DNA同同源性研究。。pBR322物理圖譜4363練習題為了繪制長為為3.0kbBamHⅠ限制性性片段的限制制性圖譜，分分別用EcoRⅠ、HpaⅡ、EcoRⅠ+HpaⅡ消化這一片片段的三個樣樣品，然后通通過凝膠電泳泳分離DNA片段，溴化化乙錠染色后后觀察DNA帶型。請根根據(jù)這些結(jié)果果繪制一個限限制性圖譜，，要標明EcoRⅠⅠ和HpaⅡ識別別位點點間的的相對對位置置，以以及它它們之之間的的距離離（kb））。EcoRⅠⅠHpaⅡEcoRⅠⅠ+HpaⅡ1.7kb0.9kb0.4kb1.6kb1.4kb1.2kb0.9kb0.4kb0.5kb3.2DNA連接接酶環(huán)形DNA分子子的發(fā)發(fā)現(xiàn)使使科學學家相相信一一定有有一種種能連連接這這種Nick的的酶存存在。。NickNick1967年年，世世界上上幾個個實驗驗室?guī)讕缀跬瑫r發(fā)發(fā)現(xiàn)了了一種種能夠夠催化化在2條DNA鏈之之間形形成磷酸二二酯鍵鍵的酶———DNA連接接酶（（ligase）。DNA連接接酶：：由大腸腸桿菌菌基因因組DNA編碼碼，以以NAD+作為能能源輔輔助因因子。。；只能能連接接粘性性末端端T4DNA連連接酶酶：由大腸腸桿菌菌T4噬菌菌體DNA編碼碼，以以ATP作作為能能源輔輔助因因子。。1970年年：容容易制制備，，而且且可以以連接接平末末端DNA分子子及單單鏈DNA(RNA)分分子，，所以以在基基因克克隆中中應用用廣泛泛。DNA連接接酶作作用的的特點點A.連連接接的兩兩條鏈鏈必須須分別別具有有3′端端自由由羥基基（-OH））和5′端磷磷酸基團（-P），，而且只有有這兩個基基團彼此相相鄰時才能能進行連接接反應；B.在羥羥基和磷酸酸基團間形形成磷酸二二酯鍵是一一種耗能過程，因此連接接反應必須須有能量分分子的參與與，通常有有兩種能量量分子，即即ATP和NAD+。是兩條鏈－－因此不能將將兩條單鏈鏈連接起來來或使單鏈鏈環(huán)化起來來。OHP××××是相鄰的－－因此不能封封閉gap，只能封封閉nick.gapNONickOKDNA連連接酶連接接的作用機機制⑴E(酶)＋＋ATP→→E－AMP＋ppiE(酶酶)＋＋NAD→→E－－AMP＋＋NMN⑵E－－AMP＋＋DNA＝＝DNA－－AMP＋＋E⑶DNA上上的的3’’－－OH對對被被活活化化的的磷磷原原子子進進行行親親核核攻攻擊擊，，形形成成磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵，，同同時時釋釋放放出出AMP。。DNA連連接接反反應應的的條條件件4℃過夜加反應液連接接反反應應最最佳佳溫溫度度為為37℃℃，，但但是是此此時時粘粘性性末末端端間間氫氫鍵鍵結(jié)結(jié)合合不不夠夠穩(wěn)穩(wěn)定定，，而而且且酶酶活活性性也也會會迅迅速速降降低低。。比比如如，，EcoRI粘粘性性末末端端連連接接部部位位只只有有4個個堿堿基基對對，，很很容容易易斷斷開開。。所所以以通常常在在4-15℃℃連接接。。影響響連連接接效效率率的的因因素素有有：：A.溫溫度度（（最最主主要要的的因因素素））B.ATP的的濃濃度度(10M-1M)C.連連接接酶酶濃濃度度（（平平末末端端較較粘粘性性末末端端要要求求高高））D.反反應應時時間間（（通通常常連連接接過過夜夜））E.插插入入片片段段和和載載體體片片段段的的摩摩爾爾比比粘性性末末端端DNA片片段段的的連連接接NickNick平末末端端DNA片片段段的的末末端端加加尾尾連連接接法法3’’3’’5’’5’’3’’3’’5’’5’’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’’3’’5’’5’’3’’3’’5’’5’’AAAAATTTTDNA聚聚合合酶酶和T4DNA連連接接酶酶同聚聚物物加加尾尾法法用5’’末末端端特特異異的的核核酸酸外外切切酶酶處處理理DNA片片斷斷在A和和B分分別別中中加加入入dATP和和dTTP同聚聚物物尾尾巴巴10~40個堿堿基基平末末端端DNA片片段段加加接接頭頭連連接接法法銜接接物物(linker)，是有有人人工工化化學學合合成成的的一一段段10-12個個核核苷苷酸酸的的DNA雙雙鏈鏈，，其其中中包包含含有有1個個或或幾幾個個限限制制性性酶酶切切位位點點。。使使用用時時只只須須將將銜銜接接物物和和目目的的片片段段的的5′′端端用用多核核苷苷酸酸激激酶酶處理理使使之之磷磷酸酸化化，，然然后后用用T4DNA連連接接酶酶進進行行連連接接，，就就可可獲獲得得能能產(chǎn)產(chǎn)生生粘粘性性末末端端的的DNA片片段段。。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸酸化化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連連接酶酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA接頭載體去去磷防防止自自連的的應用用示例例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶酶連接酶酶連接酶酶堿性磷磷酸酶酶2Pi寄主修修復缺缺口載體自自連或或產(chǎn)生生二聚聚體等等雙銜接接物連連接法法的基基本程程序cDNA鏈鏈的合合成通過DNA聚合合酶合合成第第二鏈鏈加入SalI銜接物物SI核酸酶酶作用用后的的末端端單鏈鏈突出出序列列，由Klenow補齊齊，加加入第第二銜銜接物物EcolI銜接物物缺點點在用DNA銜接接物連連接法法時，，如果果待克克隆DNA的片片斷或或基因因內(nèi)部部，含含有與與所加加銜接接物相相同的的限制制位點點，在在酶切切消化化銜接接物產(chǎn)產(chǎn)生粘粘性末末端的的同時時，也也會把把克隆隆的基基因切切斷。。DNA接頭頭（adapter）連連接法法：1978年年，美美國康康奈爾爾大學學生化化分子子生物物學系系的教教授吳吳瑞博博士發(fā)發(fā)明的的。它是一類人人工合成的的一頭具有有某種限制制酶粘性末末端另一頭頭為平末端端的特殊的的雙鏈寡核核苷酸短片片斷。粘性末端容容易通過堿堿基配對形形成如同銜銜接物一樣樣的二聚體體分子。對對DNA接接頭分子末末端，進行行必要的修修飾。移走走粘性末端端5’-P，暴露出出5’-OH，不能能產(chǎn)生穩(wěn)定定的二聚體體分子。DNA接頭頭DNA接頭頭連接法1.大大腸腸桿菌菌DNA聚聚合酶酶I2.Klenow片段段3.T4DNA聚合合酶4.T7DNA聚合合酶5.逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶（反反轉(zhuǎn)錄錄酶））6.TaqDNA聚聚合酶酶3.3DNA聚合合酶Kornberg1956年首首先從從大腸腸桿菌菌E.Coli細胞中中分離離出來來的。。它是是一種種多功功能性性的酶酶，包包括3種不不同的的酶活活力：：5′-3′聚聚合酶酶活性性以雙鏈鏈DNA為為模板板，催催化單單核苷苷酸結(jié)結(jié)合到到引物物的3′末末端，，并不不斷延延伸。。5′-3′外外切酶酶活性性將雙鏈鏈DNA中中游離離的5′末末端逐逐個切切去。。3′-5′外切切酶活性將游離的雙雙鏈或單鏈鏈DNA的的3′端降降解。不過過對于雙鏈鏈的降解可可被5′-3′的多多聚活性所所抑制。大腸桿菌DNA聚合合酶I（E.ColiDNApolI）大腸桿菌三三種DNA聚合酶特特性比較大腸桿菌聚聚合酶Ⅰ的的應用示例例缺口平移：：雙鏈DNA的單鏈缺缺口在DNA聚合酶酶Ⅰ的5’’-3’外外切作用下下，從缺口口的5’端端逐步水解解核苷酸時時，酶的聚聚合活性則則利用缺口口的3’端端游離羥基基逐個加上上相應的單單核苷酸，，使得缺口口向下游移移動。內(nèi)切酶大腸桿菌DNA聚合合酶I的的三種用途途A.制制備DNA探針利用其3′′--5′′的外切酶酶活性及其其聚合酶活活性。B.用用于DNA連接后后的大缺口口填充利用5′--3′的的聚合酶活活性。C.用用于DNA的序列列分析利用5′--3′的的聚合酶活活性。Klenow片段Klenow片段大腸桿菌聚聚合酶I全全酶經(jīng)枯草桿菌蛋蛋白酶處理后產(chǎn)生生的大片段段酶分子，，它仍然有有5′→3′的聚合合酶活性和和3′→5′′的核酸外外切酶活性性，但失去去了5′→→3′的外外切酶活性性。Klenow片段的的主要用途途修補限制性性酶消化DNA形成成的3′隱隱蔽末端標記DNA片段的末末端cDNA克克隆中第二二鏈cDNA的合成成DNA序列列的測定GAACTTAAT4DNA聚合合酶的特點點T4DNA聚合合酶從T4噬菌菌體感染了了的大腸桿桿菌中分離離出來的，，它和Klenow片段一樣樣具有5′′→3′的的聚合酶活活性和3′′→5′的核核酸外切酶酶活性。其外切酶活活性要比大大腸桿菌聚聚合酶I的活性性高200倍。特別是，T4DNA聚合酶還還有第三種種活力—取取代反應：：如果反應體體系中僅存存在一種dNTP，，這時T4DNA聚聚合酶就會會表現(xiàn)出3′→5′外外切酶活力力，從雙鏈鏈DNA的的3′開始始降解，直直到露出和和缺乏的那那中dNTP互補的的堿基，然然后就在此此位置發(fā)生生合成和取取代反應。。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++T4DNA聚合合酶的用用途1.以取取代反應應標記延延伸末端端（3’’末端））或平頭頭末端的雙鏈鏈DNA片段2.用于于DNA序列分分析T7DNA聚合合酶1000倍逆轉(zhuǎn)錄酶酶—Reversetranscriptase逆轉(zhuǎn)錄酶酶是一種可以以有效地地將mRNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成為為DNA的酶，，其產(chǎn)物物稱為cDNA(complementaryDNA).實實際上，，它也是是一種RNA依依賴的DNA聚聚合酶。。逆轉(zhuǎn)錄酶酶首先是是1970年從從鼠白血血病毒和和勞氏肉肉瘤病毒毒中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的。這兩個課課題組的的論文都都發(fā)在了了同一期期的《Nature》》雜志上上。主要用途是將mRNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基基因片段。TaqDNA聚合酶和和PCR

5’3’變性

3’5’

5’3’引物

3’5’復性

5’3’5’3’

3’5’引物3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

總結(jié)1.堿性磷磷酸酶2.核酸外外切酶3.核酸酶酶S1（nucleaseS1）4.DNase5.RNase6.T4多多聚核苷酸激激酶7.末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）3.4其他他DNA修飾飾酶堿性磷酸酶的的特性從細菌中分離的堿堿性磷酸酶酶簡稱BAP（BacterialAlkalinePhosphatase），，從小牛腸中分離的簡簡稱CAP（CalfAlkalinePhosphatase）.其其主要功能能是將DNA或RNA5′端端的磷酸切切除。其主要用途途有：A、在用32P標記DNA5′′端之前，，去除5′′端的磷酸酸；B、在DNA重組技術(shù)中中，去除DNA片段的5′磷酸，防防止載體的自身身環(huán)化。載體去磷防止止自連的應用用示例

[γ-32P]ATPATP

5’POH3’5’

32P

OH3’3’HOP5’3’HO

32P

5’

I

II

5’POH3’5’HOOH3’5’

P

OH3’3’HOP5’3’HOOH5’3’HO

P

5’

堿性磷酸酶(I)與磷酸激酶(II)活性磷酸激酶的交交換反應T4多聚核核苷酸激酶1.

催化化反應類型1)激激酶活性（5’-磷酸化化酶）：可將將ATP中的的γ位的磷酸酸基轉(zhuǎn)移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5’-羥基端端，在這反應應過程中可有有兩種方式進進行（pH7.5-8））ⅰ.轉(zhuǎn)移反應應；ⅱ.交交換反應2)3’’-磷酸酶活活性（pH5-6）2.

用途途1)5’’-端末端標標記2)分子子克隆過程中中以獲得5’’-磷酸基末末端，便于連連接酶反應核酸酶SI的的特性這是一種從米米曲霉（Aspergillusoryzae）中分離的可可以降解單鏈鏈DNA或RNA的外切切酶。其主要用途有有：A、在cDNA合成過程程中，切開cDNA的發(fā)發(fā)夾末端；B、載體構(gòu)建建過程中，切切去DNA片片段的單鏈尾尾巴，形成平末端結(jié)結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切切除單鏈尾巴的切切除末端轉(zhuǎn)移酶的的特性末端轉(zhuǎn)移酶是是一類不依賴賴于DNA模模板的DNA聚合酶。該類酶可以在在沒有模板鏈存在的情況下下，將核苷酸酸連接到DNA的在3’’羥基，特別別是對于平末末端的雙鏈DNA末端加加尾十分有效效。最常見的用途途是在酶切產(chǎn)產(chǎn)生的平末端端加尾以便于于創(chuàng)造粘性的的互補末端。。平末端DNA片段的末端端加尾連接法法3.5核酸酸探針的標記記

(geneprobe)核酸分子探針針是指用放射性性核素或其他他標記物標記記的，能與特特定的靶分子子發(fā)生特異性性相互作用的的DNA或RNA片段。。分類基因組DNA探針；病毒毒DNA等cDNA探針針（最常用））寡核苷酸探針針：10-50bpRNA探針探針的標記物物理想的標記物物：敏感度高；特特異性強；不不影響探針分分子的主要理理化特性；標標記、檢測方方法簡單、保保存時間長；；對環(huán)境無污污染、對人體體無損害；價價格低廉。分類放射性標記物物非放射性標記記物將探針標記上上一種標識物物以便雜交后后檢測。常用于標記探探針的標識物物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，，生物素-dNTP。缺口平移或切切口平移NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，，DNA酶I，DNA聚聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP隨機引物標記記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復姓末端標記法T4多核苷酸酸激酶法9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。06:00:1606:00:1606:0012/23/20226:00:16AM11、以我獨獨沈久，，愧君相相見頻。。。12月-2206:00:1606:00Dec-2223-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。06:00:1606:00:1606:00Friday,December23,202213、乍見翻疑疑夢，相悲悲各問年。。。12月-2212月-2206:00:1606:00:16December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。23十十二二月月20226:00:16上上午午06:00:1612月月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月226:00上上午12月-2206:00December23,202216、行動出成成果，工作作出財富。。。2022/12/236:00:1606:00:1623December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時時，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點的的射線向前前。。6:00:16上上午6:00上上午06:00:1612月-229、沒有失失敗，只只有暫時時停止成成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事事情努力力了未必必有結(jié)果果，但是是不努力力卻什么么改變也也沒有。。。06:00:1606:00:1606:0012/23/20226:00:16AM11、成功就是日日復一日那一一點點小小努努力的積累。。。12月-2