第二十一章基因診斷與基因治療GeneticDiagnosisandGeneTherapy基因(gene)

基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片斷，這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或各種RNA?；蜃儺愔虏☆愋蛢?nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵第一節(jié)基因診斷GeneDiagnosis

（二）、分類DNA診斷—以DNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。RNA診斷—以mRNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點(diǎn)

（一）、定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。（三）、特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)特異性高靈敏度高適用性強(qiáng)，診斷范圍廣二、基因診斷常用技術(shù)方法

（一）、核酸分子雜交技術(shù)（二）、聚合酶鏈反應(yīng)（三）、基因測(cè)序（四）、基因芯片（五）、DNA指紋（一）、核酸分子雜交(molecularhybridization)技術(shù)

核酸分子雜交可用以檢測(cè)樣本中是否存在與探針序列互補(bǔ)的同源核酸序列。

核酸探針是一類具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。

探針是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標(biāo)記之后可用來檢測(cè)目的DNA/RNA或蛋白質(zhì)分子。

實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA→(限制酶切)→凝膠電泳→膜轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影→分析建立在核酸雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法1、限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)酶譜分析法2、DNA限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析法3、等位基因特異寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)探針雜交法1、限制制性內(nèi)切切酶酶譜譜分析法法是利用限限制性內(nèi)內(nèi)切酶和和特異性性DNA探針來來檢測(cè)是是否存在在基因變變異的一一種方法法。×MstⅡⅡ酶切位點(diǎn)點(diǎn)(CCTNAGG)5′3′正?；蛞?′3′突變基因因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)細(xì)胞貧血血患者基基因組的的限制性性酶切分分析A→T+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶帶著患者鐮狀紅細(xì)細(xì)胞貧血血患者基基因組的的限制性性酶切分分析2、DNA-RFLP分析法法中性突變變是指在人人基因組組中，平平均每200對(duì)對(duì)堿基可可發(fā)生一一對(duì)變異異的現(xiàn)象象。DNA多多態(tài)性是指中性性突變導(dǎo)導(dǎo)致個(gè)體體間核苷苷酸序列列的差異異。限制性片片段長度度多態(tài)性性是指DNA多態(tài)態(tài)性若發(fā)發(fā)生在限限制性內(nèi)內(nèi)切酶識(shí)識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)上，酶酶切水解解該DNA片段段就會(huì)產(chǎn)產(chǎn)生長度度不同的的片段。。RFLP分析法3、ASO雜交交法根據(jù)已知知基因突突變位點(diǎn)點(diǎn)的核苷苷酸序列列，人工工合成相相應(yīng)于正正常和突突變基因因堿基序序列的兩兩種寡核核苷酸探探針，用用它們分分別與受受檢者DNA進(jìn)進(jìn)行分子子雜交來來檢測(cè)是是否存在在等位基基因突變變。ASO雜雜交法探針：MNMNMNMN正?；蛞蚣兗兒贤蛔冏冸s雜合突變變基基因缺陷陷（新新的的突突變變類類型型？？））+﹣（二二））、、聚聚合合酶酶鏈鏈反反應(yīng)應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)是利利用用特特異異的的引引物物，，特特異異地地?cái)U(kuò)擴(kuò)增增目目的的DNA的的方方法法。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)流流程程：：提取取DNA→→PCR→→凝凝膠膠電電泳泳→→顯顯色色→→分分析析5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555551、基本工工作原理Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。2、常用的PCR方法：常規(guī)PCR、巢式PCR、多多重PCR、多種PCR、不不對(duì)稱PCR、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR、定量反反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差異異顯示PCR、原位位PCR、、實(shí)時(shí)PCR等等。。3、在PCR技術(shù)基基礎(chǔ)上的常常用基因診診斷方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶譜法法PCR-STR（短串聯(lián)重重復(fù)序列，，shorttandemrepeat））SSCP是是指相同長長度的單鏈鏈DNA因因其堿基序序列不同，，甚至單個(gè)個(gè)堿基不同同，都可能能形成不同同的空間構(gòu)構(gòu)象，從而而在中性聚聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳時(shí)泳動(dòng)速速率不同的的現(xiàn)象。單鏈構(gòu)象多多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR-SSCP分分析是指PCR產(chǎn)物變性性后，經(jīng)聚聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳，正?；蚝妥儺惍惢虻倪w遷移位置不不同，借此此可分析確確定致病基基因的存在在。正常人純合突變雜合突變Leber遺傳性性神經(jīng)病患患者PCR/SSCP分析析（線粒體DNA第11778位G→A所致）+﹣（三）、基基因測(cè)序(genesequencing)即測(cè)定某一一基因的堿堿基序列。。實(shí)驗(yàn)流程：：提取DNA→分離出出有關(guān)基因因→測(cè)序→→分析診斷斷基因測(cè)序的的方法：化學(xué)裂解法法DNA鏈末末端合成終終止法DNA自動(dòng)動(dòng)測(cè)序（四）、基基因芯片（（genechip)基因芯片，，又稱DNA芯片、、DNA陣陣列、寡核核苷酸微芯芯片（DNAchip、DNAarrays、oligonucleotidemicro-chip）—是指將許多多特定的寡寡核苷酸片片段或基因因片段作為為探針，有有規(guī)律地排排列固定于于支持物上上，然后與與待測(cè)的標(biāo)標(biāo)記樣品的的基因按堿堿基配對(duì)原原理進(jìn)行雜雜交，再通通過激光聚聚焦熒光檢檢測(cè)系統(tǒng)等等對(duì)芯片進(jìn)進(jìn)行掃描，，并配以計(jì)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)統(tǒng)對(duì)每一探探針上的熒熒光信號(hào)作作出比較和和檢測(cè)，從從而迅速得得出定性和和定量的結(jié)結(jié)果。基因因芯芯片片的的應(yīng)應(yīng)用用1、、在在診診斷斷中中的的應(yīng)應(yīng)用用核酸酸序序列列分分析析、、基基因因表表達(dá)達(dá)分分析析、、尋尋找找新新基基因因、、突突變變基基因因和和基基因因多多態(tài)態(tài)性性檢檢測(cè)測(cè)等等2、、在在藥藥學(xué)學(xué)研研究究中中的的應(yīng)應(yīng)用用藥物物篩篩選選、、藥藥物物作作用用機(jī)機(jī)制制研研究究、、耐耐藥藥菌菌株株、、藥藥敏敏檢檢測(cè)測(cè)、、毒毒理理學(xué)學(xué)研研究究、、環(huán)環(huán)境境化化學(xué)學(xué)毒毒物物的的篩篩選選、、基基因因掃掃描描等等（五五））、、DNA指紋紋(DNAfingerprint)在人人基基因因組組DNA中有有高高度度可可變變的的““小小衛(wèi)衛(wèi)星星””區(qū)區(qū)域域，，采采用用““小小衛(wèi)衛(wèi)星星””基基因因探探針針，，在在同同一一限限制制酶酶切切產(chǎn)產(chǎn)物物的的DNA雜雜交交圖譜譜上上，，同同一一個(gè)個(gè)體體不不同同組組織織來來源源的的DNA的譜譜帶帶完完全全一一致致，，而而不不同同個(gè)個(gè)體體之之間間（（同同卵卵雙雙生生除除外外））譜譜帶帶都都不不相相同同，，如如同同人人的的指指紋紋具具有有高高度度個(gè)個(gè)體體特特異異性性一一樣樣，，因因此此這這種種雜交交圖譜譜被被稱稱為為DNA指紋紋或或遺遺傳傳指指紋紋（geneticfingerprint））。簡(jiǎn)言言之之：：DNA指紋紋或或遺遺傳傳指指紋紋是是指指采用用““小小衛(wèi)衛(wèi)星星””基基因因探探針針進(jìn)行行DNA分子子雜雜交交（Southern印跡跡，，Southernblotting））所得得的的圖圖譜譜。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)流流程程：：提取取DNA→→限限制制酶酶切切→→凝凝膠膠電電泳泳→→膜膜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移→→雜雜交交→→放放射射自自顯顯影影→→分分析析三、基因因診斷的的應(yīng)用遺傳疾病病腫瘤感染性疾疾病傳染性流流行病判斷個(gè)體體疾病易易感性器官移植植組織配配型法醫(yī)學(xué)中中個(gè)體識(shí)識(shí)別、親親子鑒定定總結(jié)基因診斷斷的概念念、特點(diǎn)點(diǎn)、常用用的技術(shù)術(shù)方法及及應(yīng)用。。復(fù)習(xí)題1、名詞詞解釋：：基因診斷斷、DNA診斷斷、RNA診斷斷、RFLP分析、、SSCP、基基因芯片片、DNA指紋紋2、簡(jiǎn)述述基因診診斷的特特點(diǎn)、常常用技術(shù)術(shù)方法及及可用于于診斷的的疾病。。簡(jiǎn)述基基因變異異致病的的類型及及內(nèi)源性性基因變變異的類類型。簡(jiǎn)簡(jiǎn)述限制制性內(nèi)切切酶譜分分析法、、ASO探針雜雜交法、、PCR-SSCP分分析、基基因芯片片、DNA指紋紋等的實(shí)實(shí)驗(yàn)流程程。第二節(jié)節(jié)基因治療療GeneTherapy（一）、、基因治治療的概概念早期是指用正正常的基基因整合合入細(xì)胞胞基因組組，以校校正和置置換致病病基因的的一種治治療方法法。目前廣義上來來講是指指將某種種遺傳物物質(zhì)轉(zhuǎn)移移到患者者細(xì)胞內(nèi)內(nèi)，使其其在體內(nèi)內(nèi)發(fā)揮作作用，以以達(dá)到治治療疾病病目的的的方法。。一、基因因治療的的概念（二）、、基因治治療的基基本方法法1、基因因矯正(genecorrection)2、基因因置換(genereplacement)3、基因因增補(bǔ)(geneaugmentation)4、基因因失活(geneinactivation)1、基因因矯正(genecorrection)指將致病病基因的的異常堿堿基進(jìn)行行糾正，，而正常常部分予予以保留留。納米鉗AGCTGTGAAGTCGTGTCGACACTTCAGCACabnormalgeneGenecorrectionnormalgeneTACG2、基因因置換(genereplacement)指用正常常的基因因通過體體內(nèi)基因因同源重重組，原原位替換換致病基基因，使使細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的DNA完全全恢復(fù)正正常狀態(tài)態(tài)。AGCTGTGC

AAGTCGTGTCGACACG

TTCAGCACnormalgeneAGCTGTGCAAGTCGTGTCGACACGTTCAGCACnormalgeneAGCTGTGT

AAGTCGTGTCGACACATTCAGCACabnormalgeneGenereplacement3、基因因增補(bǔ)(geneaugmentation)將目的基基因?qū)肴氩∽兗?xì)細(xì)胞或其其他細(xì)胞胞，不去去除異常?；颍?，而是通通過目的的基因的的非定點(diǎn)點(diǎn)整合，，使其表表達(dá)產(chǎn)物物彌補(bǔ)缺缺陷基因因的功能能或使原原有基因因表達(dá)增增強(qiáng)。AGCTGTGC

AAGTCGTGTCGACACG

TTCAGCACnormalgeneAGCTGTGT

AAGTCGTGTCGACACA

TTCAGCACabnormalgeneGeneaugmentation4、基因因失活(geneinactivation)指將特定定的序列列導(dǎo)入細(xì)細(xì)胞后，，在轉(zhuǎn)錄錄或翻譯譯水平阻阻斷某些些基因的的異常表表達(dá)，已已達(dá)到治治療疾病病的目的的。幾種常見的基基因失活技術(shù)術(shù)反義核酸技術(shù)術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技技術(shù)肽核酸基因敲除①反義(antisence)核酸酸技術(shù)是指用人工合合成的RNA或DNA來來阻斷基因的的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制制，使編碼基基因不能轉(zhuǎn)錄錄為mRNA，因而不能能翻譯成相應(yīng)應(yīng)的蛋白質(zhì)。。反義RNA技技術(shù)反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)，且且能抑制與疾疾病發(fā)生直接接相關(guān)基因表表達(dá)的RNA。反義RNA技技術(shù)是指利用反義義RNA在mRNA水平平上封閉基因因表達(dá)，最終終可通過調(diào)節(jié)節(jié)劑量，來治治療由基因突突變或過度表表達(dá)所致的疾疾病或嚴(yán)重感感染性疾病。。TCGACACA

TTCAGCACAGCTGTGT

AAGTCGTGabnormalgeneGeneinactivationabnormalmRNAUCGACACAUUCAGCAC反義RNAAGCUGUGUAAGUCGUGAbnormalproteinAbnormalprotein②核酶(ribozyme)技術(shù)通過核酶分子子結(jié)合到靶RNA分子中中適當(dāng)?shù)牟课晃?，形成錘頭頭核酶結(jié)構(gòu)，，催化對(duì)靶RNA分子的的剪切，從而而破壞靶RNA分子達(dá)到到治療疾病的的目的。5’3’5’3’靶RNA核酶分子核酶技術(shù)③三鏈技術(shù)(triplexapproach)又稱為反基因策略(antigenestragegy)，是利用脫氧氧寡核苷酸能能與雙螺旋雙雙鏈DNA專專一性序列結(jié)結(jié)合，形成三三鏈DNA，，從而在轉(zhuǎn)錄錄水平或復(fù)制制水平阻止基基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)復(fù)制的技術(shù)。。能形成三鏈鏈DNA的的脫氧寡核核苷酸稱為為三鏈DNA形成脫脫氧寡核苷苷酸（triplex-formingoligonucleotide,TFO)。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄錄三鏈DNA技術(shù)④干擾RNA(interferenceRNA,RNAi)技術(shù)RNAi是指在特定定因子作用用下，有導(dǎo)導(dǎo)入胞內(nèi)的的雙鏈RNA降解生生成的約22nt左左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。RNAi技技術(shù)是指利用堿堿基互補(bǔ)配配對(duì)原則，，使RNAi和靶DNA結(jié)合合，同時(shí)誘誘導(dǎo)激活體體內(nèi)的基因因沉默因子子，從而使使靶DNA降解。dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解解干擾RNA技術(shù)RNAiRNAi技技術(shù)的特點(diǎn)點(diǎn)特異性強(qiáng)效率性高作用時(shí)間長長可通過細(xì)胞胞屏障而發(fā)發(fā)揮作用⑤肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)技術(shù)PNA是指DNA-肽復(fù)合合物。PNA技術(shù)術(shù)是利用多肽肽與DNA的特異性性結(jié)合，專專一地抑制制某一基因因的表達(dá)。。肽肽核酸技術(shù)術(shù)⑥基因敲除除(geneknock-out)技術(shù)指有目的的的去除動(dòng)物物體內(nèi)某種種基因的技技術(shù)。（三）、基基因治療的的其他方法法1、“自殺殺基因”的的應(yīng)用某些病毒或或細(xì)菌的基基因所表達(dá)達(dá)的酶能將將對(duì)人體無無毒或低毒毒的藥物前前體在人體體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞胞毒性產(chǎn)物物，從而導(dǎo)導(dǎo)致攜帶該該基因的受受體細(xì)胞也也被殺死，，故稱這類類基因?yàn)樽宰詺⒒?。。自殺殺基基因因無毒毒、、低低毒毒的的藥藥物物前前體體→→→→細(xì)胞胞毒毒性性產(chǎn)產(chǎn)物物→細(xì)胞胞死死亡亡2、、基基因因疫疫苗苗的的應(yīng)應(yīng)用用將編編碼碼外外源源性性抗抗原原的的基基因因插插入入到到含含真真核核表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)的的質(zhì)質(zhì)粒粒上上，，然然后后將將質(zhì)質(zhì)粒粒直直接接導(dǎo)導(dǎo)入入人人或或動(dòng)動(dòng)物物體體內(nèi)內(nèi)，，讓讓其其在在宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)表表達(dá)達(dá)抗抗原原蛋蛋白白，，誘誘導(dǎo)導(dǎo)機(jī)機(jī)體體產(chǎn)產(chǎn)生生免免疫疫應(yīng)應(yīng)答答。。重組組表表達(dá)達(dá)質(zhì)質(zhì)粒粒外源源性性抗抗原原基基因因基因因疫疫苗苗二、、基基因因治治療療的的基基本本程程序序一、、治治療療性性基基因因的的選選擇擇目的的基基因因的的選選擇擇二、、基基因因載載體體的的選選擇擇三、、靶靶細(xì)細(xì)胞胞的的選選擇擇四、、基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移五、、外外源源基基因因表表達(dá)達(dá)的的篩篩選選利用用載載體體中中的的標(biāo)標(biāo)記記基基因因有neor標(biāo)記記基基因因時(shí)時(shí)，，用用418進(jìn)進(jìn)行行篩篩選選六、、回回輸輸體體內(nèi)內(nèi)靜脈脈回回輸輸自自體體骨骨髓髓移移植植埋入入皮皮下下組組織織病毒毒載載體體**非病病毒毒載載體體體細(xì)細(xì)胞胞生殖殖細(xì)細(xì)胞胞間接接體體內(nèi)內(nèi)療療法法(exvivo)直接接體體內(nèi)內(nèi)療療法法(invivo)常見見基基因因載載體體的的優(yōu)優(yōu)缺缺點(diǎn)點(diǎn)載體體優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)缺缺點(diǎn)點(diǎn)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒基基因因組組小小并并且且簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單僅僅感感染染分分裂裂細(xì)細(xì)胞胞穩(wěn)定定整整合合于于宿宿主主基基因因組組隨隨機(jī)機(jī)整整合合可可能能導(dǎo)導(dǎo)致致突突變變生物物學(xué)學(xué)特特性性清清楚楚常常常常只只有有短短暫暫表表達(dá)達(dá)可高高效效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入復(fù)復(fù)制制中中的的細(xì)細(xì)胞胞病病毒毒滴滴度度低低107pfu/ml對(duì)宿宿主主無無害害可可能能會(huì)會(huì)于于有有復(fù)復(fù)制制能能力力的的病病毒毒重重組組腺病病毒毒相相關(guān)關(guān)病病毒毒基基因因組組小小未未知知可特特異異整整合合于于人人染染色色體體19q需需腺腺病病毒毒輔輔助助復(fù)復(fù)制制以人人細(xì)細(xì)胞胞作作為為宿宿主主攜攜帶帶外外源源基基因因能能力力有有限限無毒毒，，無無致致病病性性難難得得到到高高滴滴度度病病毒毒腺病病毒毒適適用用于于原原位位使使用用，，尤尤其其是是肺肺不不與與宿宿主主基基因因整整合合在不分分裂細(xì)細(xì)胞中中可進(jìn)進(jìn)行高高效率率只只有短短暫表表達(dá)的體內(nèi)內(nèi)感染染無無特異異性靶靶細(xì)胞胞病毒滴滴度高高1010pfu/ml病病毒蛋蛋白可可引起起免疫疫反應(yīng)應(yīng)和炎炎癥反反應(yīng)生物學(xué)學(xué)特性性清楚楚插插入外外源基基因能能力有有限脂質(zhì)體體無無感感染能能力無無特特異性性靶細(xì)細(xì)胞理論上上無DNA大小小限制制轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染效率率低毒性低低僅僅有短短暫表表達(dá)，，體內(nèi)內(nèi)應(yīng)用用困難難受體介介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)無無感感染能能力轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效效率低低特異性轉(zhuǎn)染靶靶細(xì)胞體體內(nèi)應(yīng)用困困難理論上無DNA大小限制制可可能能有免疫原性性構(gòu)建靈活只只有短暫暫表達(dá)載體優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)缺缺點(diǎn)三、基因治療療的應(yīng)用與展展望(一）、應(yīng)用用遺傳性疾病、、心血管疾病病、腫瘤、感感染性疾病、、神經(jīng)系統(tǒng)疾疾病1、是單基因因缺陷病2、是體細(xì)胞胞病3、靶細(xì)胞易易獲取、培養(yǎng)養(yǎng)、操作、回回輸4、治療效果果甚于危害5、無需嚴(yán)格格的表達(dá)水平平調(diào)控6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證明符合嚴(yán)嚴(yán)格的安全標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)基因治療研究究的病種應(yīng)該該符合的條件件(二)、展望望進(jìn)一步尋找切切實(shí)有效的基基因精密調(diào)控外源源基因在人體體內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建安全、高高效、靶向、、可控載體體細(xì)胞移植和和重建的生物物學(xué)研究減少外源基因因?qū)C(jī)體的不不利影響本節(jié)重點(diǎn)提示示基因治療的概概念、方法、、基本程序9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中中黃葉葉樹，，燈下下白頭頭人。。。06:10:5206:10:5206:1012/23/20226:10:52AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2206:10:5206:10Dec-2223-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。06:10:5206:10:5206:10Friday,December23,202213、乍見見翻疑疑夢(mèng)，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2206:10:5206:10:52December23,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。23十二二月20226:10:52上上午06:10:5212月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:10上上午12月-2206:10December23,202216、行動(dòng)出成成果，工作作出財(cái)富。。。2022/12/236:10:5206:10:5223December202217、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時(shí)，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。6:10:52上午6:10上上午06:10:5212月-229、沒有失失敗，只只有暫時(shí)時(shí)停止成成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事事情努力力了未必必有結(jié)果果，但是是不努力力卻什么么改變也也沒有。。。06:10:5206:10:5206:1012/23/20226:10:52AM11、成功功就是是日復(fù)復(fù)一日日那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小努力力的積積累。。。12月月-2206:10:5206:10Dec-2223-Dec-2212、世間間成事事，不不求其其絕對(duì)對(duì)圓滿滿，留留一份份不足足，可可得無無限完完美。。。06:10:5206:10:5206:10Friday,December23,202213、不知香積積寺，數(shù)里里入云峰。。。12月-2212月-2206:10:5