第八講能夠傳染致病的蛋白質(zhì)子

——普列昂

1997年度諾貝爾獎生理及醫(yī)學(xué)獎授予

表彰他在研究和發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)性質(zhì)致病因子(普列昂)中所做的貢獻(xiàn)。

他是不尋常的諾貝爾獎獲得者

普魯西納1942年5月28日生，1968年獲美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位。1984年起任加利福尼亞大學(xué)神經(jīng)學(xué)、病毒學(xué)教授。返回(1)諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎歷來頒發(fā)給在學(xué)術(shù)界已獲普遍承認(rèn)和推崇的突破性的研究成果。但是，普列昂的研究，直到頒獎時仍存在著較大的爭議。(2)諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎，通常由二至數(shù)名科學(xué)家共享。一人獨攬的例子甚少，為1987年來僅有，近40年中只發(fā)生6次。返回

病源物引發(fā)傳染病的罪魁禍?zhǔn)住≡次?/p>

作為病源物的真核生物

病源物傳染病

低等動物

血吸蟲血吸蟲病

繞蟲繞蟲病

原生動物

瘧原蟲瘧疾

睡眠蟲嗜睡病

變形蟲阿米巴痢疾血吸蟲的生活史返回瘧原蟲的生活史返回真菌（霉菌和酵母）

霉菌

皮膚、指甲真菌感染

白假絲酵母

鵝口瘡

肺組織胞漿菌病一、作為病原物的細(xì)菌和病毒1、細(xì)菌是原核生物

細(xì)菌很小，一般直徑為0.5－5m,大約為動、植物細(xì)胞的幾百分之一。

細(xì)菌

百日咳白喉破傷風(fēng)

風(fēng)濕病肺炎痢疾

炭疽傷寒鼠疫

梅毒淋病膿腫

結(jié)核

齲齒

立克次氏體

斑疹傷寒

支原體

類胸膜肺炎/非典型性肺炎

衣原體

沙眼

病毒流感、脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）

腮腺炎肺炎麻疹

天花肝炎狂犬病返回侵蝕牙齒的釉質(zhì)而形成空洞。細(xì)菌附在牙齒表面，產(chǎn)生酸，金字塔中的雕刻表明4000年前古埃及已記載有小兒麻痹癥病人返回上述各種病源物的共同特點:

它們都是生物。

細(xì)胞形態(tài)生物：低等動物、原生動物、

真菌、細(xì)菌、

立克次氏體、衣原體。

非細(xì)胞形態(tài)生物：病毒針尖上的大腸桿菌返回原核細(xì)胞沒有細(xì)胞核，但有DNA，仍然是DNA分子貯存遺傳密碼。返回返回葡萄球菌桿菌螺旋菌用鞭毛泳動的桿菌用結(jié)晶紫染色1分鐘用碘液沖洗3分鐘用酒精沖洗20秒用沙黃復(fù)染2分鐘ExamplesofGramStaining煙草花葉病毒腺病毒噬菌體皰疹病毒返回ii.病毒是活細(xì)胞內(nèi)專性寄生的生物。

病毒繁殖（復(fù)制）在寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。

以噬菌體為例：

附著——識別過程。

侵染——病毒核酸進(jìn)入寄主細(xì)胞。

復(fù)制——復(fù)制病毒核酸，合成病毒外殼蛋白質(zhì)。

組裝——形成一批子代病毒粒子。

裂解——寄主細(xì)胞破裂，釋出病毒粒子。噬菌體的生活史返回附著復(fù)制組裝侵染裂解

病毒粒子的直徑約

0.1微米（100nm）;

病毒仍然以核酸作為遺傳物質(zhì);

后來又發(fā)現(xiàn)類病毒，僅是一條RNA鏈，沒有蛋白質(zhì)衣殼包裹。

細(xì)菌和病毒（包括類病毒）都符合公認(rèn)的“中心法則”。DNADNARNA蛋白質(zhì)中心法則（1）從發(fā)病動物分出純培養(yǎng)物。（2）再接種到健康動物，引起同樣疾病。（3）再分離出純培養(yǎng)，應(yīng)和接種的培養(yǎng)物具相同特性。證實病源物的柯赫法則流感病毒流感病毒（influenzavirus）是引起世界性、周期性大流行流感的病原體。其中1918年的流行中全球共有數(shù)千萬人死于流感，以后每隔數(shù)年即有流感在廣大區(qū)域內(nèi)的流行。詳細(xì)資料感冒與流感癥狀 感冒 流感發(fā)燒 少見 常見（39－40oC）頭痛 少見 常見全身不適 較輕 嚴(yán)重，可持續(xù)數(shù)周流涕 常見 較不常見，量少喉嚨疼痛 常見 較不常見嘔吐、腹瀉 少見 常見流感病毒（InfluenzaVirus）螺旋對稱，具包膜HA，血凝素NA，神經(jīng)氨酸酶螺旋對稱核衣殼脂質(zhì)雙層膜多聚酶M1，基質(zhì)蛋白流感病毒的結(jié)構(gòu)分型核蛋白有型特異性，依核蛋白不同分為甲、乙、丙三型病毒的變異抗原性漂移（antigenicdrift）抗原性轉(zhuǎn)換（antigenicshift）編碼表面抗原（H、N）基因點突變累積導(dǎo)致了抗原位點的改變基因重組或動物源性抗原轉(zhuǎn)換大型變異：H、N均大變異，約30-40年發(fā)生一次，可致大流行或暴發(fā)流行。甲型流感病毒變異亞型變異：H大變異，N不變或小變異約10年發(fā)生一次，可致大流行。變種變異：H、N均小變異，經(jīng)常發(fā)生，導(dǎo)致小流行。乙型流感病毒只有變種變異丙型流感病毒相對穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)變異流感病毒病毒基因：甲、乙型流感病毒基因組為單鏈負(fù)義RNA，均含有8個節(jié)段，而丙型流感病毒則缺少一個編碼神經(jīng)氨酸酶的RNA節(jié)段。流感病毒致病性與免疫性：多數(shù)病人病后一周左右開始恢復(fù)。在排毒高峰后出現(xiàn)干擾素產(chǎn)生，但維持時間短暫，接著很快出現(xiàn)特異性抗體，此類抗體有兩種，一是抗血凝素抗體，能阻斷病毒侵入易感細(xì)胞；另一種是抗神經(jīng)氨酸酶抗體，能減少細(xì)胞排出病毒的次數(shù)和防止病毒擴(kuò)散。這些體液免疫只對同一抗原亞型有效，一般維持1~2年。流感病毒遺傳學(xué)流感病毒的HA和NA:15個HA血清型(H1,H2,H3…H15)9個NA亞型(N1,N2,…N9)人流感病毒：H1，H2，H3；N1，N2，N8M1蛋白核衣殼(RNA加NP蛋白)HA-血凝素多聚酶雙層脂膜NA-神經(jīng)氨酸酶各種亞型的病毒在鴨和其它鳥類中流行豬在病毒從鳥類到人中有重要的作用：重排的場所鴨病毒人病毒共同感染豬感染人流感病毒遺傳學(xué)1957年的流感病毒保留原來的5條基因，從鳥類病毒得到了3條基因：HA，NA和PB1成為流行的H2N2，1968年的流感病毒保留了1957年病毒的六條基因片段從鳥類病毒獲得兩條基因片段：HA和PB1成為H3N21997香港禽流感1997香港：學(xué)齡兒童因患流感死亡流感病毒血清型：H5N1，系禽流感引起恐慌，全體雞鴨遭滅頂之災(zāi)不同亞型的禽流感病毒感染人類后可引起不同的臨床癥狀感染H9N2亞型的患者通常僅有輕微的上呼吸道感染癥狀，部分患者甚至沒有任何癥狀感染H7N7亞型的患者主要表現(xiàn)為結(jié)膜炎；H5N1亞型病毒患者呈急性起病，早期表現(xiàn)類似普通型流感。主要為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在39℃以上，熱程1～7天，一般為3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛、肌肉酸痛和全身不適。部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等消化道癥狀。病情發(fā)展迅速，可出現(xiàn)肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細(xì)胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克等多種并發(fā)癥。白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。禽流感為什么要恐慌？H5從未在人中發(fā)現(xiàn)：一種新的重排病毒？如果確實對人具有高感染力和高毒力，由于人群中沒有任何抗體，后果不堪設(shè)想中國：禽類數(shù)量世界第一；農(nóng)村畜禽混養(yǎng)；養(yǎng)殖水平差；醫(yī)療條件不健全返回

二、“慢病毒”引起的疾病18世紀(jì)

冰島羊搔癢病

1920s

H.Creutzfieldt人克-雅氏病

A.Jacob

1950s

巴布亞－新幾內(nèi)亞Kuru病Gajdusek

1980s

英國瘋牛病

病程很慢，都有神經(jīng)系統(tǒng)退行性癥狀;腦部出現(xiàn)淀粉樣沉淀，

形成海綿狀空斑。返回一名CJ病患者的大腦皮層切片，可以看到腦組織里的海綿狀空斑。

對這類疾病的研究，以羊搔癢病為代表，困難很大：

發(fā)病率低

病程慢

傳染病/遺傳病不清楚

病因/病原物找不到

人們只能猜想：

有一種“慢病毒”在起作用

（1）從發(fā)病動物分出純培養(yǎng)物。（2）再接種到健康動物，引起同樣疾病。（3）再分離出純培養(yǎng)，應(yīng)和接種的培養(yǎng)物具相同特性。返回證實病源物的柯赫法則

三、普列昂的發(fā)現(xiàn)

1、以改進(jìn)檢測方法為突破點

目標(biāo)：分離、純化病原物、并加以鑒定，每一步都離不開檢測方法。

第一個進(jìn)步：把搔癢病從羊轉(zhuǎn)至小鼠發(fā)病潛伏期3－5年4－5個月第二個進(jìn)步：檢測方法終點滴度檢測法：用小鼠作實驗材料接種給小鼠150天鼠腦中病原物的滴度最高分離純化步驟15－30天再接種給小鼠4－5個月出現(xiàn)病癥潛伏期檢測法:用倉鼠作實驗材料終點滴度檢測法潛伏期檢測法(例行的檢測方法)(改進(jìn)后的檢測方法)

12個月70天60只小鼠4只倉鼠

總共加快速度100倍返回

2、得到難以公布的實驗結(jié)果

原來預(yù)期得到小型病毒。

結(jié)果，所有實驗數(shù)據(jù)都表明:病原物不是小型病毒，不含核酸，而是蛋白質(zhì)粒子。

經(jīng)過八年努力（1974－1982）1982年發(fā)表第一篇文章：

提出羊搔癢病病源物是一種蛋白質(zhì)粒子。蛋白質(zhì)類的感染顆粒（ProteinoceousInfectiousParticle,Prion）

普列昂概念的提出，引起軒然大波。

許多人問：沒有核酸，這個病原物如何增殖？如何復(fù)制本身的遺傳信息。

許多人懷疑：可能還是存在核酸，只是未能檢測出來。具有諷刺意味的是：

最早提出實驗證據(jù)，證明核酸是遺傳信息載體的是Avery1942年有關(guān)肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子的實驗。當(dāng)時，Avery的報告未能引起多大重視。有人懷疑轉(zhuǎn)化因子中起作用的是蛋白質(zhì)，只是Avery未能檢測出來。返回關(guān)鍵在于普利昂是否含有核酸？

普魯西納：

在尋找核酸上，D.Riesuer和我所花的功夫比其他任何人都多。

3、更深入的研究，更意外的結(jié)果

隨著研究的深入，得到更多打破傳統(tǒng)觀念的結(jié)果：

（1）尋找Prn－p基因

編碼普列昂蛋白（PrP）的基因，不但在染病動物腦中存在，亦在正常動物腦中找到，而且表達(dá)得一樣多。圖PrPscPrP

c看來，PrP蛋白不是病鼠才有。而且，PrPsc的出現(xiàn)不是調(diào)節(jié)基因起作用的結(jié)果。返回正常小鼠得病小鼠分別把Prn－p基因在正常和染病小鼠中的表達(dá)產(chǎn)物稱為：

（2）普列昂蛋白（PrPc）在正常動物腦中的功能是什么？

找不到答案。

剔除PrP基因的遺傳工程小鼠（PrP%）,看不出病癥，似乎一切正常，亦能正常生育。

（3）PrP%小鼠作出貢獻(xiàn)

把染病小鼠的腦提取物接種給PrP%小鼠，后者不染病。同樣的腦提取物，接種給普通小鼠PrP+/+，后者被染病。圖染病小鼠腦提取物看來，PrPc的存在是染病的必要前提返回PrP%小鼠PrP+/+小鼠

（4）對PrPc和PrPsc

兩種蛋白質(zhì)做結(jié)構(gòu)分析。

都是由208個氨基酸殘基組成的疏水性很強(qiáng)糖蛋白。

氨基酸序列

RNA剪輯

翻譯后修飾

均無差別

（5）最后，終于找到差別

PrPc和PrPsc在高級結(jié)構(gòu)上有巨大差別

PrPcPrPsc

α－螺旋40％21％

β－折疊3％54%圖返回PrPcPrPc

(上)

PrPsc(下)

（6）PrPc和PrPsc在高級結(jié)構(gòu)上的差別,在細(xì)胞內(nèi)的行為和代謝特征上也反映出來。

PrPcPrPsc

胞內(nèi)定位細(xì)胞表面胞質(zhì)內(nèi)

蛋白酶水解水解完全局部水解

（7）綜合上面得到的結(jié)果，提出一個理論設(shè)想：

搔癢病的發(fā)生是因為PrPsc

的入侵，把腦細(xì)胞中原來就有的PrPc

“帶壞”，使PrPc

重新折疊，形成新的高級結(jié)構(gòu)，變成了PrPsc

。

增多的PrPsc

形成淀粉樣斑，造成腦細(xì)胞破壞，出現(xiàn)空斑。

(b)接著，初始和新形成的搔癢病粒子就攻擊另外的兩個正常的PrP分子細(xì)胞質(zhì)核搔癢病PrP正常PrP原有的PrP分子轉(zhuǎn)化了的PrP分子(a)搔癢病PrP的一個分子(紅色)和正常的PrP分子(褐色)相接觸并以某種方式展開而形成搔癢病構(gòu)型時(c)后者反過來又去攻擊其他正常分子，以此方式連續(xù)進(jìn)行下去直至搔癢病PrP積累到危害量。返回什么叫PrPsc把

PrPc“帶壞”？實際上是：蛋白質(zhì)大分子與蛋白質(zhì)大分子之間的相互作用。生物大分子之間的相互作用還包括蛋白質(zhì)——核酸之間的相互作用。蛋白質(zhì)核酸兩種大分子的識別和結(jié)合亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)與DNA的結(jié)合糜蛋白酶的高級結(jié)構(gòu)呈桶狀有利底物的裝入糜蛋白酶－芳香族側(cè)鏈胃蛋白酶－帶正電荷側(cè)鏈彈性蛋白酶－短鏈無電荷側(cè)鏈在催化位點，顯示出三種酶蛋白有不同專一性——要求底物具不同的側(cè)鏈。抗體和抗原的識別和結(jié)合抗體可變區(qū)特異地識別和結(jié)合抗原分子。

（8）蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)大分子間相互作用。

PrPsc把PrPc“帶壞”。

這個基本的理論設(shè)想，除了以上述實驗為基礎(chǔ)，還進(jìn)一步得到以后實驗支持。

轉(zhuǎn)染過程發(fā)病潛伏期

用病倉鼠的PrPsc

感染小鼠500天

在小鼠中連

續(xù)傳代后

140天

用病小鼠的PrPsc

感染倉鼠400天

在倉鼠中連

續(xù)傳代后75天

倉鼠PrPsc感染接受

倉鼠PrP基因的轉(zhuǎn)