彌漫性肺泡出血小鼠注射依托泊苷的效果分析,藥理學(xué)論文摘要：目的討論依托泊苷對pristane誘導(dǎo)的彌漫性肺泡出血(diffusealveolarhemorrhage,DAH)小鼠肺組織細胞凋亡的影響。方式方法24只小鼠隨機分為對照組、模型組和依托泊苷組，每組8只。模型組和依托泊苷組腹腔單次注射0.5mLpristane制備DAH模型，對照組給予等量PBS。造模成功后，依托泊苷組腹腔注射10mg/kg依托泊苷，對照組和模型組腹腔注射等量PBS,均1次/d,連續(xù)14d。14d后，取3組小鼠肺組織進行組織病理檢查，HE染色觀察小鼠肺組織出血情況和炎癥細胞浸潤情況，采用TUNEL染色試劑盒檢測3組小鼠肺組織細胞凋亡率，采用Westernblot法檢測3組小鼠肺組織caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表示出量。結(jié)果對照組小鼠肺組織大體呈正常粉紅色，模型組為暗紅色，依托泊苷組可見散在出血點。對照組小鼠肺泡構(gòu)造完好，肺泡腔清楚明晰，肺組織炎癥細胞浸潤不明顯；模型組小鼠肺泡腔出現(xiàn)大量紅細胞，伴大量中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤；依托泊苷組肺泡腔無明顯紅細胞，肺泡壁增厚。模型組小鼠肺組織細胞凋亡率[(7.870.79)%]及Bax、caspase-3蛋白相對表示出量(0.870.01、2.110.17)高于對照組[(0.780.13)%、0.240.02、0.190.01]和依托泊苷組[(1.490.24)%、0.320.01、0.830.06](P0.05),依托泊苷組高于對照組(P0.05);模型組小鼠Bcl-2蛋白相對表示出量(0.750.07)低于對照組(2.860.19)和依托泊苷組(5.620.21)(P0.05),依托泊苷組高于對照組(P0.05)。結(jié)論依托泊苷對DAH小鼠有治療作用，可明顯改善小鼠肺組織肺泡出血和炎癥細胞浸潤，降低肺組織細胞凋亡率，其機制可能與調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表示出有關(guān)。本文關(guān)鍵詞語：彌漫性肺泡出血;依托泊苷;細胞凋亡;小鼠;Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofetoposideonlungtissuecellsapoptosisinmicewithdiffusealveolarhemorrhageinducedbypristane.MethodsTwenty-fourmicewererandomlypidedintocontrolgroup,modelgroupandetoposidegroup,with8miceineachgroup.Themiceinmodelgroupandetoposidegroupweregivenasingleintraperitonealinjectionof0.5mLofpristanetoprepareDAHmodels,andthemiceincontrolgroupweregiventhesameamountofPBSbuffer.Aftersuccessfulmodeling,themiceinetoposidegroupwereintraperitoneallyinjectedwith10mg/kgetoposide,andthemiceincontrolgroupandmodelgroupweregiventhesameamountofPBSbuffer,onceadayfor14consecutivedays.After14days,thelungtissueswereobtainedforhistopathologicalexamination.HEstainingwasusedtoobservethehemorrhageandinflammatorycellinfiltrationinthelungtissues,TUNELstainingkitwasusedtodetecttheapoptosisrate,andWesternblotmethodwasusedtodetecttherelativeexpressionsofcaspase-3,BaxandBcl-2proteinsinthelungtissuesofthreegroups.ResultsThelungtissuesweregenerallyinnormalpinkincontrolgroup,wereindarkredinmodelgroup,andwerefoundscatteredbleedingpointsinetoposidegroup.Themiceincontrolgrouphadintactalveolarstructure,clearalveolarcavity,andunobviousinfiltrationofinflammatorycellsinthelungtissues.Themiceinmodelgrouphadalargenumberofredbloodcellsinthealveolarcavity,accompaniedbyalargenumberofneutrophils,macrophagesandotherinflammatorycellsinfiltration.Themiceinetoposidegrouphadnoobviousredbloodcellsinthealveolarcavity,andthealveolarwallswerethickened.TheapoptosisrateoflungcellsandtherelativeexpressionsofBaxandcaspase-3proteinswerehigherinmodelgroup((7.870.79)%,0.870.01,2.110.17)thanthoseincontrolgroup((0.780.13)%,0.240.02,0.190.01)andetoposidegroup((1.490.24)%,0.320.01,0.830.06)(P0.05),andhigherinetoposidegroupthanthoseincontrolgroup(P0.05).TherelativeexpressionofBcl-2proteinwaslowerinmodelgroup(0.750.07)thanthatincontrolgroup(2.860.19)andetoposidegroup(5.620.21)(P0.05),andlowerinetoposidegroupthanthatincontrolgroup(P0.05).ConclusionEtoposidehasatherapeuticeffectonDAHmice.Itcansignificantlyalliviatealveolarhemorrhageandinflammatorycellinfiltrationinthelungtissuesofmice,andreducetheapoptosisrateofthelungcells.ThemechanismmightbecorrelatedwithregulatingtheexpressionsofBax,Bcl-2andcaspase-3proteins.Keyword：diffusealveolarhemorrhage;etoposide;apoptosis;mice;彌漫性肺泡出血(diffusealveolarhemorrhage,DAH)是一種以咯血、缺鐵性貧血和彌漫性肺泡浸潤為特征的臨床綜合征[1],多種本身免疫性疾病均可引起DAH,系統(tǒng)性紅斑狼瘡引起的占多數(shù)[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡并發(fā)DAH雖較罕見，但病死率較高，為50%～70%[3,4,5]。DAH在臨床中常用皮質(zhì)類固醇緩解，聯(lián)合采用血漿置換免疫吸附療法，約50%患者復(fù)發(fā)，需采用皮質(zhì)類固醇聯(lián)合免疫抑制劑維持[6]。依托泊苷臨床用于巨噬細胞活化綜合征[7]和噬血細胞綜合征[8]的治療，未在本身免疫疾病中應(yīng)用。采用pristane誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生狼瘡DAH模型，肺毛細血管炎癥在形態(tài)上與人系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的DAH類似[9]。本研究討論DAH的可能機制及依托泊苷對DAH小鼠的抗凋亡作用，報道如下。1、材料與方式方法1.1、一般材料清潔的雌性C57BL/6小鼠24只，8～12周齡，體質(zhì)量18～20g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物實驗許可證號：SCXK(京)2020-0004]。將小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)生命科學(xué)院SPF級別的動物房中，室溫(23.00.5)℃,晝夜節(jié)律12h,小鼠可自由獲取清潔的水和食物，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。24只小鼠隨機分為對照組、模型組和依托泊苷組，每組8只。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準(倫理批準號：2022178)。1.2、方式方法1.2.1、主要試劑依托泊苷(索萊寶生物科技有限公司),pristane(美國Sigma公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔抗鼠Bax、Bcl-2、caspase-3一抗及二抗(美國Abcam公司)。1.2.2、小鼠DAH模型建立及實驗方式方法模型組和依托泊苷組小鼠腹腔單次注射0.5mLpristane建立DAH模型，對照組給予等量PBS。造模成功后，依托泊苷組小鼠腹腔注射10mg/kg依托泊苷，對照組和模型組小鼠腹腔注射等量PBS,均1次/d,連續(xù)14d。1.2.3、標本采集與小鼠肺組織病理檢查藥物干涉14d后，小鼠施行安泰死取肺組織。左肺組織固定于體積分數(shù)4%多聚甲醛中固定48h,常規(guī)石蠟包埋，切成3.5m切片。將切片依次放入二甲苯和梯度乙醇，沖洗后，蘇木精染色5min,體積分數(shù)5%乙酸分化1min,伊紅染色1min,梯度乙醇中脫水，晾干，滴上中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)，采集圖像。1.2.4、TUNEL法檢測小鼠肺組織細胞凋亡率石蠟包埋的小鼠肺組織切片在二甲苯、無水乙醇、乙醇中進行脫蠟脫水，滴加蛋白酶K37℃孵育25min,PBS液搖洗3次，破膜液破膜后洗滌，參加TUNEL試劑盒內(nèi)試劑1(TdT)、試劑2(dUTP)和試劑3(buffer)按1:5:50混合，37℃孵育2h后PBS洗滌3次，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。采用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，應(yīng)用Halov3.0.311.314軟件分析各組細胞凋亡圖像。計算細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)100%。1.2.5、Westernblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白相對表示出量取右肺組織20mg剪碎，參加200LRIPA勻漿，冰上裂解30min,4℃,12000g離心20min,取上清，采用BCA法檢測蛋白濃度，取30g蛋白樣品SDS電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂牛奶封閉1h,分別參加一抗-actin(1:1000)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、caspase-3(1:1000),4℃過夜，TBST洗3次，參加二抗抗兔IgG-HRP(1:1000),常溫孵育1h,TBST洗3次，使用ECL顯色試劑盒顯示蛋白條帶并應(yīng)用ImageJ軟件處理并拍照，采用Gel-ProApplication進行分析，以-actin為內(nèi)參，計算Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白相對表示出量。實驗重復(fù)3次。1.3、統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)標準差(x?s)表示，多組比擬采用單因素方差分析，組間兩兩比擬采用LSD檢驗；檢驗水準=0.05。2、結(jié)果2.1、3組小鼠組織病理檢查結(jié)果(1)大體：對照組小鼠肺組織無出血點，呈正常粉紅色；模型組小鼠肺組織呈暗紅色；依托泊苷組小鼠肺組織可見出血情況較模型組明顯改善，呈少量出血點。見圖1。(2)鏡下：對照組小鼠肺組織肺泡構(gòu)造清楚明晰，肺泡壁光滑，肺組織炎癥細胞浸潤不明顯；模型組小鼠肺組織構(gòu)造異常，肺泡腔有大量紅細胞浸潤，間質(zhì)可見大量中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤；與模型組比擬，依托泊苷組小鼠肺組織出血明顯減少，間質(zhì)中炎癥細胞浸潤減少，肺泡壁增厚。見圖2。圖13組小鼠肺組織大體觀察圖注:a為對照組，可見正常肺組織，呈淡粉色；b為模型組，可見嚴重出血肺組織；c為依托泊苷組，可見肺組織散在出血點。圖23組小鼠肺組織病理圖〔HE染色，400)注:a為對照組，可見肺泡構(gòu)造清楚明晰；b為模型組，可見肺泡中大量紅細胞，間質(zhì)中大量炎癥細胞浸潤；c為依托泊苷組，可見肺泡壁增厚，間質(zhì)中炎癥細胞浸潤較少。2.2、3組小鼠肺組織細胞凋亡率比擬3組小鼠肺組織細胞凋亡率比擬差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=184.6,P=0.001)。模型組小鼠肺組織細胞凋亡率[(7.870.79)%]高于對照組[(0.780.13)%]和依托泊苷組[(1.490.24)%](P0.05),依托泊苷組高于對照組(P0.05)。見圖3。圖33組小鼠肺組織細胞TUNEL染色圖〔TUNEL染色，100)注:a為對照組，無凋亡細胞；b為模型組，可見大量凋亡細胞；c為依托泊苷組，可見少量凋亡細胞。綠色熒光為凋亡細胞。2.3、3組小鼠肺組織Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相對表示出量比擬3組小鼠肺組織Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相對表示出量比擬差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型組小鼠肺組織Bax、caspase-3蛋白相對表示出量高于對照組和依托泊苷組(P0.05),Bcl-2蛋白相對表示出量低于對照組和依托泊苷組(P0.05)。依托泊苷組小鼠肺組織Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白相對表示出量高于對照組(P0.05)。見表1及圖4。表13組小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白相對表示出量比擬注:a與對照組比擬，P0.05;b與模型組比擬，P0.05。圖43組小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表示出Westernblot圖注:1為對照組；2為模型組；3為依托泊苷組。3、討論DAH是系統(tǒng)性紅斑狼瘡罕見但致命的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為咯血，伴不同程度的呼吸困難，廣泛肺內(nèi)出血及炎癥細胞浸潤[10],其發(fā)病機制當前尚未說明。pristane可在嚙齒動物中誘發(fā)狼瘡，與人類疾病中系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有共同的臨床和病理特征，在C57BL/6小鼠中給予pristane可誘導(dǎo)DAH的動物模型[4]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織大面積出血，肺泡腔中大量紅細胞滲出，伴有大量炎癥細胞滲出，而對照組無紅細胞，炎癥細胞浸潤不明顯；提示DAH模型建造成功。凋亡可能是DAH的始動環(huán)節(jié)[11]。由pristane誘導(dǎo)的凋亡細胞最初可產(chǎn)生本身免疫性底物，引起免疫耐受毀壞，巨噬細胞去除缺乏，導(dǎo)致本身免疫疾病的發(fā)展，巨噬細胞浸潤和細胞凋亡可能是引發(fā)DAH的關(guān)鍵因素[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織細胞凋亡率高于對照組和依托泊苷組，依托泊苷組高于對照組；講明模型組小鼠肺組織凋亡細胞明顯增加，伴有嚴重肺組織損傷和肺部出血，而依托泊苷組凋亡細胞減少，肺部損傷和出血明顯改善；提示抑制細胞凋亡可從始動環(huán)節(jié)抑制DAH進展，改善肺部損傷，為從抑制凋亡途徑治療本身免疫病提供新途徑。pristane可通過激活caspase途徑抑制細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡[13],可通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，F(xiàn)as介入華而不實。Bcl-2是主要的凋亡抑制因子，通過維持線粒體外膜的完好性，抑制線粒體凋亡途徑的啟動[14]。Bax是Bcl-2的同源基因，其高表示出可促進細胞凋亡，加速DAH中肺組織損傷。Bcl-2可與Bax競爭性結(jié)合，抑制Bax活化，進而有效抑制細胞凋亡[15]。凋亡因子caspase-3介入細胞的生長、分化和凋亡，其表示出上調(diào)可促進肺組織病變的發(fā)生和發(fā)展[16]。caspase-3是內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑的共同執(zhí)行蛋白，caspase-3表示出加強可作為啟動凋亡的重要標志[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組肺組織Bax、caspase-3蛋白相對表示出量高于對照組和依托泊苷組，Bcl-2蛋白相對表示出量低于對照組和依托泊苷組；依托泊苷組小鼠肺組織Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白相對表示出量高于對照組；講明采用依托泊苷治療的DAH小鼠肺組織Bax、caspase-3蛋白表示出降低，Bcl-2表示出增高；提示依托泊苷可通過促進線粒體誘導(dǎo)的凋亡途徑中抑制凋亡因子Bcl-2表示出減輕細胞凋亡，通過降低caspase-3表示出抑制凋亡的啟動，進而減輕肺損傷。本研究結(jié)果顯示，依托泊苷對DAH有明顯治療效果，其機制可能是調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表示出，進而減輕肺組織細胞凋亡。DAH屬本身免疫性疾病，在臨床中多采用激素和免疫抑制劑進行治療，僅部分有效，停藥后易復(fù)發(fā)，無特效治療方式方法。依托泊苷在DAH小鼠模型中的療效可為臨床DAH治療提供新的方向，可以能擴寬依托泊苷在臨床中的應(yīng)用。以下為參考文獻[1]MITTOOS,FELLCD.Pulmonarymanifestationsofsystemiclupuserythematosus[J].SeminRespirCritCareMed,2020,35(2):249-254.[2]PROSTND,PARROTA,CUQUEMELLEE,etal.Diffusealveolarhemorrhageinimmunocompetentpatients:etiologiesandprognosisrevisited[J].RespirMed,2020,106(7):1021-1032.[3]SANTOS-OCAMPOAS,MANDELLBF,FESSLERBJ.Alveolarhemorrhageinsystemiclupuserythematosus:presentationandmanagement[J].Chest,2000,118(4):1083-1090.[4]BARKERTT,LEEPY,KELLY-SCUMPIAKM,etal.PathogenicroleofBcellsinthedevelopmentofdiffusealveolarhemorrhageinducedbypristane[J].LabInvest,2018,91(10):1540-1550.[5]SMITHS,WUPW,SEOJJ,etal.IL-16/miR-125aaxiscontrolsneutrophilrecruitmentinpristane-inducedlunginflammation[J].JCIInsight,2021,3(15):e120798.[6]STOOTSSA,LIEFL,ERKAND.Clinicalinsightsintodiffusealveolarhemorrhageinantiphospholipidsyndrome[J].CurrRheumatolRep,2022,21(10):56.[7]SEFSAFIZ,HASBAOUIBE,KILIA,etal.Macrophageactivationsyndromeassociatedwithgriscellisyndrometype2:casereportandreviewofliterature[J].PanAfrMedJ,2021,29:75.[8]KOBAYASHIR,TANAKAJ,HASHINOS,etal.Etoposide-containingconditioningregimenreducestheoccurrenceofhemophagocyticlymphohistiocytosisafterSCT[J].BoneMarrowTransplant,2020,49(2):254-257.[9]CHOWDHARYVR,GRANDEJP,LUTHRAHS,etal.Characterizationofhaemorrhagicpulmonarycapillaritis:anothermanifestationofpristane-inducedlupus[J].Rheumatology(Oxford),2007,46(9):1405-1410.[10]張偉，包慎，馬燕萍，等.急性早幼粒細胞白血病并發(fā)彌漫性出血性